Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta sa CSS.Alang sa labing kaayo nga kasinatian, among girekomenda nga mogamit ka usa ka bag-ong browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Sa kasamtangan, aron masiguro ang padayon nga suporta, among ihatag ang site nga walay mga estilo ug JavaScript.
Ang mga pamaagi sa pag-label sa Enzymatic proximity base sa gi-aktibo nga mga ester o phenoxy radical kay kaylap nga gigamit sa pagmapa sa mga subcellular nga proteome ug mga interaksyon sa protina sa buhi nga mga selula.Bisan pa, ang gi-aktibo nga mga ester dili kaayo reaktibo, nga nagresulta sa usa ka lapad nga radius sa pag-label, ug ang mga radikal nga phenoxy nga namugna sa pagtambal sa peroxide mahimong makabalda sa mga agianan sa redox.Dinhi among gi-report ang usa ka pamaagi sa pag-label nga nagsalig sa photoactivation (PDPL) nga duol nga gimugna pinaagi sa genetically linking sa miniSOG photosensitizer nga protina sa usa ka protina nga interes.Na-trigger sa asul nga kahayag ug kontrolado sa oras sa pagkaladlad, ang singlet nga oxygen namugna ug dayon ang spatiotemporally nasulbad nga pag-label sa histidine residues pinaagi sa aniline probe makab-ot.Gipakita namo ang taas nga pagkamatinud-anon niini pinaagi sa pagmapa sa proteome nga espesipiko sa organelle.Ang usa ka kilid nga pagtandi sa PDPL sa TurboID nagpakita sa usa ka mas espesipiko ug komprehensibo nga proteomic coverage sa PDPL.Sunod, among gipadapat ang PDPL sa sakit nga nalangkit sa transcriptional coactivator nga BRD4 ug E3 Parkin ligase ug nakit-an ang wala pa mailhi nga mga interaksyon.Pinaagi sa overexpression screening, duha ka wala mailhi nga substrate, Ssu72 ug SNW1, giila alang sa Parkin, kansang pagkadaot gipataliwala sa ubiquitination-proteasome nga agianan.
Ang tukma nga paghulagway sa mga network sa protina nagpailalom sa daghang sukaranan nga mga proseso sa cellular.Busa, ang tukma kaayo nga spatiotemporal mapping sa mga interaksyon sa protina maghatag ug molekular nga basehanan sa pag-decipher sa mga biological pathways, patolohiya sa sakit, ug pagbungkag niini nga mga interaksyon alang sa mga katuyoan sa pagtambal.Alang niini, ang mga pamaagi nga makahimo sa pag-ila sa temporal nga mga interaksyon sa buhi nga mga selula o mga tisyu maayo kaayo.Ang Affinity Purification Mass Spectrometry (AP-MS) sa kasaysayan gigamit sa pag-ila sa nagbugkos nga mga kasosyo sa mga protina sa interes (POIs).Sa pag-uswag sa mga pamaagi sa quantitative proteomics, ang Bioplex3.0 gimugna, ang pinakadako nga database sa mga network sa protina base sa AP-MS.Bisan kung gamhanan kaayo ang AP-MS, ang cell lysis ug dilution nga mga lakang sa workflow gipihig ngadto sa huyang ug lumalabay nga pagbugkos nga mga interaksyon ug gipaila ang post-lysis nga mga artifact sama sa dili tinuod nga mga pares sa interaksyon nga kulang sa compartmentalization sa wala pa ang lysis.
Aron matubag kini nga mga isyu, ang dili natural nga mga amino acid (UAA) nga adunay crosslinking nga mga grupo ug enzymatic nga duol nga labeling (PL) nga mga plataporma (eg APEX ug BioID)5 naugmad.Bisan kung ang pamaagi sa UAA malampuson nga gigamit sa daghang mga senaryo ug naghatag kasayuran sa direkta nga mga adhesive sa protina, gikinahanglan gihapon ang pag-optimize sa site sa pagsulud sa UAA.Labaw sa tanan, kini usa ka stoichiometric nga pamaagi sa pag-label nga kulang sa usa ka catalytic nga pagbag-o sa mga panghitabo sa pag-label.Sa kasukwahi, ang mga pamaagi sa enzymatic PL, sama sa pamaagi sa BioID, nagsagol sa engineered biotin ligase ngadto sa POI7, nga sa ulahi nagpalihok sa biotin aron mahimong usa ka reaktibo nga biotinyl-AMP ester intermediate.Ang enzyme sa ingon nag-catalyze ug nagpagawas sa usa ka aktibo nga biotin nga "panganod" nga nagbutang sa mga proximal lysine residues.Bisan pa, ang BioID nanginahanglan labaw pa sa 12 ka oras aron makakuha usa ka igo nga marka nga signal, nga nagpugong sa paggamit niini sa temporal nga resolusyon.Gamit ang gitumong nga ebolusyon base sa yeast display, ang TurboID gidesinyo base sa BioID aron mahimong mas episyente, nga nagtugot sa episyente nga pag-label gamit ang biotin sulod sa 10 minutos, nga nagtugot sa mas dinamikong mga proseso nga matun-an.Tungod kay ang TurboID aktibo kaayo ug ang endogenous nga lebel sa biotin igo na alang sa ubos nga lebel nga pag-label, ang pag-label sa background mahimong usa ka potensyal nga problema kung gikinahanglan ang labi nga gipaayo ug gitakda nga pag-label pinaagi sa pagdugang sa exogenous biotin.Dugang pa, ang gi-aktibo nga mga ester dili maayo nga reaktibo (t1 / 2 ~ 5 min), nga mahimong mosangput sa usa ka dako nga radius sa pag-label, labi na pagkahuman sa saturation sa mga silingan nga protina nga adunay biotin 5. Sa laing paagi, ang genetic fusion sa engineered ascorbate peroxidase (ie biotin- phenol radicals ug nagtugot sa pag-label sa protina sulod sa usa ka minuto9,10. Ang APEX kaylap nga gigamit sa pag-ila sa mga subcellular proteomes, membrane protein complexes, ug cytosolic signaling protein complexes11,12. Bisan pa, ang panginahanglan alang sa taas nga konsentrasyon sa peroxide mahimong makaapekto sa redox protein o mga agianan, nga makabalda. mga proseso sa cellular.
Busa, ang usa ka bag-ong pamaagi nga makahimo sa pagmugna og mas reaktibo nga gimarkahan nga mga espisye sa pagsumpo sa radius nga adunay taas nga spatial ug temporal nga katukma nga wala’y hinungdan nga makabalda sa mga agianan sa cellular mahimong usa ka hinungdanon nga pagdugang sa naglungtad nga mga pamaagi. Taliwala sa mga reaktibo nga espisye, ang singlet nga oxygen nakapukaw sa among atensyon tungod sa mubo nga kinabuhi ug limitado nga radius sa pagsabwag (t1 / 2 <0.6 µs sa mga selyula)13. Taliwala sa mga reaktibo nga espisye, ang singlet nga oxygen nakapukaw sa among atensyon tungod sa mubo nga kinabuhi ug limitado nga radius sa pagsabwag (t1 / 2 <0.6 µs sa mga selyula)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограсниче и ограслород из-за его короткого времени жизни и ограсниче и ограсниче и ограслород из-за его короткого времени жизни и ограгниче и ограсниче/6 мердиноче кислород Lakip sa mga aktibo nga porma, ang singlet nga oxygen nakadani sa among atensyon tungod sa mubo nga kinabuhi ug limitado nga radius sa pagsabwag (t1 / 2 <0.6 µs sa mga selyula)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs）走们起们起们起们起们。 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограница и ограница и ограница и ограница и ограница и 6 словочный кислород. Taliwala sa mga aktibo nga porma, ang singlet nga oxygen nakadani sa atong atensyon tungod sa mubo nga kinabuhi niini ug limitado nga radius sa pagsabwag (t1/2 <0.6 μs sa mga selula).Ang singlet oxygen gikataho nga random nga mag-oxidize sa methionine, tyrosine, histidine ug tryptophan, nga naghimo niini nga polar 14,15 alang sa pagdugtong sa amine o thiol based probes16,17.Bisan kung ang singlet nga oxygen gigamit sa pag-label sa subcellular compartment nga RNA, ang mga estratehiya alang sa pag-repurpos sa endogenous POI nga mga marka sa kaduol nagpabilin nga wala masusi.Dinhi, among gipresentar ang usa ka plataporma nga gitawag nga photoactivation-dependent proximity labeling (PDPL), diin naggamit kami og asul nga kahayag aron sa pagdan-ag sa mga POI nga gisagol sa usa ka miniSOG nga photosensitizer ug pag-trigger sa singlet nga henerasyon sa oxygen aron ma-oxidize ang mga proximal nga residues, nga gisundan sa mga pagbag-o nga adunay amine aron ma-oxidize ang mga chemical probes ngadto sa intermediate buhi nga mga selula..Gisulayan namo ang usa ka grupo sa mga kemikal nga probe aron mapadako ang espesipiko sa tag ug giila nga mga site sa pagbag-o gamit ang usa ka bukas nga proteomics workflow.Ang usa ka kilid nga pagtandi sa PDPL sa TurboID nagpakita sa usa ka mas espesipiko ug komprehensibo nga proteomic coverage sa PDPL.Among gipadapat kini nga pamaagi sa organelle-specific marker sa subcellular proteome ug general proteome identification sa binding partners alang sa cancer-associated epigenetic regulatory protein BRD4 ug ang Parkinson's disease-associated E3 ligase Parkin, nga nagpamatuod sa usa ka nailhan ug usa ka wala mailhi nga network sa protina. interaksyon..Ang katakus sa PDPL sa pag-ila sa mga substrate sa E3 sa dagkong mga complex sa protina nagrepresentar sa usa ka sitwasyon diin gikinahanglan ang pag-ila sa dili direkta nga mga binder.Duha ka wala mailhi nga mga substrate sa parkin nga gipataliwala sa ubiquitination-proteasome ang nakumpirma sa situ.
Photodynamic therapy (PDT)19 ug chromophore-assisted laser inactivation (CALI)20, diin ang light irradiation uban sa mga photosensitizers makamugna og singlet nga oxygen, maka-inactivate sa target proteins o makapahinabog cell death.Tungod kay ang singlet nga oxygen usa ka reaktibo nga substansiya nga adunay usa ka theoretical diffusion nga gilay-on nga mga 70 nm, ang limitado nga spatially nga oksihenasyon sa palibot sa photosensitizer mahimong makontrol.Pinasukad niini nga konsepto, nakahukom kami nga gamiton ang singlet nga oxygen aron makab-ot ang suod nga pagmarka sa mga komplikado nga protina sa buhi nga mga selula.Naghimo kami og usa ka PDPL chemoproteomic nga pamaagi aron matuman ang upat ka mga gimbuhaton: (1) sa pag-catalyze sa henerasyon sa aktibong singlet nga oxygen nga susama sa PL enzymatic approach;(2) paghatag ug time-resolved labeling sa light initiation;(3) pinaagi sa pag-usab (4) Likayi ang paggamit sa endogenous cofactor (sama sa biotin) aron makunhuran ang background, o gamita ang labi ka makasamok nga mga exogenous reagents (sama sa peroxide) aron maminusan ang pagkaladlad sa cell sa stress sa palibot.
Ang mga photosensitizer mahimong bahinon ngadto sa duha ka mga kategoriya lakip na ang gagmay nga molecular weight nga mga fluorophores (eg rose bengal, methylene blue)22 ug genetically encoded nga gagmay nga mga protina (eg miniSOG, KillerRed)23.Aron makab-ot ang usa ka modular nga disenyo, among gipalambo ang unang henerasyon nga plataporma sa PDPL pinaagi sa pagdugang sa mga protina sa photosensitizer (PS) sa POI24,25 (Figure 1a).Kung gi-irradiated sa asul nga kahayag, ang singlet nga oxygen mag-oxidize sa proximal nucleophilic amino acid residues, nga moresulta sa usa ka umpolung polarity nga electrophilic ug mahimong dugang nga reaksyon sa amine probe nucleophiles16,17.Ang probe gidisenyo nga adunay alkyne handle aron tugotan ang click chemistry ug ibira paubos para sa LC/MS/MS characterization.
Ilustrasyon sa eskematiko sa pag-label sa mga komplikadong protina nga gipataliwad-an sa miniSOG.Kung naladlad sa asul nga kahayag, ang mga selyula nga nagpahayag sa miniSOG-POI nagpatunghag singlet nga oxygen, nga nagbag-o sa mga nag-interact nga mga protina apan dili mga non-binding protein.Ang mga intermediate nga produkto sa photooxidation gi-intercept sa mga relay label sa amine chemical probe aron maporma ang covalent adducts.Ang grupo nga alkynyl sa chemistry probe nagtugot sa click chemistry alang sa pagpalambo pinaagi sa pull-down nga gisundan sa LC-MS/MS quantitation.b Kemikal nga istruktura sa amine probes 1-4.c Representative fluorescent gel analysis sa mitochondrial localized miniSOG-mediated proteomic marker gamit ang probes 1-4 ug relative quantification base sa gel densitometry.Ang signal-to-background nga ratio sa mga kemikal nga probes gisusi gamit ang negatibo nga mga eksperimento sa pagkontrol nga wala'y labot ang asul nga kahayag o gamit ang HEK293T nga mga selula nga walay miniSOG nga ekspresyon.n = 2 biologically independente nga mga sample.Ang matag tulbok nagrepresentar sa usa ka biolohikal nga kopya.d Representative detection ug quantification sa PDPL gamit ang optimized probe 3 sa presensya o pagkawala sa gipakita nga PDPL component sama sa c.n = 3 biologically independente nga mga sample.Ang matag tulbok nagrepresentar sa usa ka biolohikal nga kopya.Ang mga centerline ug whisker nagrepresentar sa mean ug ± standard deviation.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Confocal imaging sa singlet oxygen nga adunay layo nga pula nga Si-DMA nga mantsa.Scale bar: 10 µm.Ang gel imaging ug confocal nga mga eksperimento independente nga gisubli labing menos kaduha nga adunay parehas nga mga resulta.
Una namong gisulayan ang abilidad sa hamtong nga mga photosensitizer nga miniSOG26 ug KillerRed23, nga lig-on nga gipahayag sa HEK293T, aron sa pagpataliwala sa propargylamine labeling sa proteome isip chemical probe (Supplementary Fig. 1a).Ang pag-analisa sa fluorescence sa gel nagpakita nga ang tibuuk nga pag-label sa proteome nakab-ot gamit ang miniSOG ug blue light irradiation, samtang wala’y makita nga produkto sa pag-label nga naobserbahan sa KillerRed.Aron mapauswag ang ratio sa signal-to-background, gisulayan dayon namo ang usa ka hugpong sa mga kemikal nga probes nga adunay aniline (1 ug 3), propylamine (2), o benzylamine (4).Among naobserbahan nga ang HEK293T nga mga selula mismo adunay mas taas nga signal sa background kon itandi sa walay asul nga kahayag, lagmit tungod sa endogenous riboflavin photosensitizer, flavin mononucleotide (FMN) 27. Ang aniline-based chemical probes 1 ug 3 naghatag og mas maayo nga espesipiko, uban sa HEK293T nga lig-on nga nagpahayag sa miniSOG sa mitochondria nga nagpakita sa usa ka> 8-pilo nga pagtaas sa signal alang sa probe 3, samtang ang probe 2 nga gigamit sa RNA-labeling nga pamaagi CAP-seq nagpakita lamang ~ 2.5- fold signal increase, lagmit tungod sa lain-laing reactivity preferences tali sa RNA ug protina (Fig. 1b, c). Ang aniline-based chemical probes 1 ug 3 naghatag og mas maayo nga espesipiko, uban sa HEK293T nga lig-on nga nagpahayag sa miniSOG sa mitochondria nga nagpakita sa usa ka> 8-pilo nga pagtaas sa signal alang sa probe 3, samtang ang probe 2 nga gigamit sa RNA-labeling nga pamaagi CAP-seq nagpakita lamang ~ 2.5- fold signal increase, lagmit tungod sa lain-laing reactivity preferences tali sa RNA ug protina (Fig. 1b, c).Ang kemikal nga probes nga nakabase sa aniline 1 ug 3 nagpakita sa mas maayo nga espesipiko: HEK293T, nga lig-on nga nagpahayag sa miniSOG sa mitochondria, nagpakita labaw pa sa 8 ka pilo nga pagtaas sa signal alang sa probe 3, samtang ang probe 2, gigamit sa CAP-seq RNA nga pamaagi sa pag-label, lamang nagpakita ~ 2.5-pilo nga pagtaas sa signal, tingali tungod sa lain-laing reactivity preferences tali sa RNA ug protina (Fig. 1b, c).基于基于 的 化学 探针 1 和 3 具有 好 的 特异性, HEKS 在在 粒体 中 的 的 于 于 的 于 的 的 的 的 的 ~ ~ 显示 ~ 显示 ~ 显示 ~ 显示 ~ 显示 ~ 2.5-信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于基于 的 化学 探针 1 和 3 具有 的 的 粒体 中 稳定 表达 的 而 的 的 的 的 的 的 的 2 的 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ -倍信号增加，可能是由于RNAAng aniline-based nga kemikal nga mga probes 1 ug 3 adunay mas maayo nga espesipiko, HEK293T stably gipahayag miniSOG sa mitochondria, ug probe 3 adunay sa ibabaw sa 8-pilo nga pagtaas sa signal, samtang ang probe 2 alang sa CAP-seq RNA labeling pamaagi nagpakita lamang ~ 2.5-pilo nga pagtaas.sa signal, tingali tungod sa lain-laing mga gusto reaksyon tali sa RNA ug protina (Fig. 1b, c).Dugang pa, ang probe 3 isomers ug hydrazine probes (probes 5, 6, 7) gisulayan, nga nagpamatuod sa pag-optimize sa probe 3 (Supplementary Fig. 1b, c).Sa susama, ang in-gel fluorescence analysis nagpadayag sa ubang mga optimized experimental parameters: irradiation wavelength (460 nm), chemical probe concentration (1 mM), ug irradiation time (20 min) (Supplementary Fig. 2a-c).Ang pagtangtang sa bisan unsa nga component o lakang sa PDPL protocol miresulta sa mahinungdanon nga pagbag-o sa signal sa background (Fig. 1d).Ilabi na, ang pag-label sa protina labi nga nakunhuran sa presensya sa sodium azide o trolox, nga nahibal-an nga makapalong sa singlet oxygen.Ang presensya sa D2O, nga nahibal-an nga nagpalig-on sa singlet nga oxygen, nagpauswag sa signal sa pag-label.Aron imbestigahan ang kontribusyon sa ubang mga reaktibo nga espisye sa oksiheno sa pag-label, ang mannitol ug bitamina C gidugang aron matukod ang hydroxyl ug superoxide radical scavengers, matag usa, 18, 29, apan wala sila nakit-an nga makunhuran ang pag-label.Ang pagdugang sa H2O2, apan dili ang kahayag, wala moresulta sa pag-label (Supplementary Fig. 3a).Ang fluorescence singlet oxygen imaging nga adunay Si-DMA probes nagpamatuod sa presensya sa singlet oxygen sa HEK293T-miniSOG wire, apan dili sa orihinal nga HEK293T wire.Dugang pa, ang mitoSOX Red dili makamatikod sa produksyon sa superoxide human sa paglamdag (Fig. 1e ug Supplementary Fig. 3b) 30. Kini nga mga datos kusganong nagsugyot nga ang singlet oxygen mao ang nag-unang reactive oxygen species nga responsable sa sunod nga proteomic labeling.Ang cytotoxicity sa PDPL gi-assess lakip na ang blue light irradiation ug chemical probes, ug walay mahinungdanon nga cytotoxicity ang naobserbahan (Supplementary Fig. 4a).
Aron matun-an ang mekanismo sa pag-label ug makahimo sa proteomic nga pag-ila sa mga complex sa protina gamit ang LC-MS/MS, kinahanglan una natong mahibal-an kung unsang mga amino acid ang giusab ug ang delta mass sa mga label sa probe.Ang methionine, histidine, tryptophan ug tyrosine gikataho nga giusab pinaagi sa singlet oxygen14,15.Among gihiusa ang TOP-ABPP31 workflow sa walay bias nga open search nga gihatag sa FragPipe computing platform base sa MSFragger32.Pagkahuman sa pagbag-o sa singlet nga oxygen ug pag-label sa kemikal nga pagsusi, ang pag-klik sa chemistry gihimo gamit ang label nga pagkunhod sa biotin nga adunay sulud nga cleavable linker, gisundan sa pag-inat sa neutravidin ug pagtunaw sa trypsin.Ang giusab nga peptide, gigapos gihapon sa resin, gi-photocleaved alang sa LC-MS / MS analysis (Figure 2a ug Supplementary Data 1).Daghang mga pagbag-o ang nahitabo sa tibuuk nga proteome nga adunay sobra sa 50 nga peptide map (PSM) nga mga posporo nga gilista (Fig. 2b).Katingad-an, naobserbahan ra namon ang pagbag-o sa histidine, tingali tungod sa mas taas nga reaksyon sa oxidized histidine ngadto sa aniline probes kaysa sa ubang mga amino acid.Sumala sa gipatik nga mekanismo sa histidine oxidation pinaagi sa singlet oxygen, 21,33 ang gisugyot nga delta-mass structure sa +229 Da katumbas sa adduct sa probe 3 nga adunay 2-oxo-histidine human sa duha ka oksihenasyon, samtang ang +247 Da mao ang hydrolysis nga produkto sa +229 Da (Supplementary Fig. 5).Ang ebalwasyon sa MS2 spectrum nagpakita sa taas nga kasaligan sa pag-ila sa kadaghanan sa mga y ug b ions, lakip ang pag-ila sa giusab nga mga fragment ions (y ug b) (Fig. 2c).Ang pag-analisar sa konteksto sa lokal nga han-ay sa PDPL-modified histidines nagpadayag sa usa ka kasarangan nga motif nga gusto alang sa gagmay nga hydrophobic residues sa ± 1 nga mga posisyon (Supplementary Fig. 4b).Sa aberids, ang 1.4 histidines giila kada protina, ug ang mga dapit niini nga mga marker gitino pinaagi sa solvent accessible surface area (SASA) ug relative solvent availability (RSA) analysis (Supplementary Fig. 4c, d).
Usa ka walay pagpihig nga dagan sa trabaho alang sa pagtuon sa residual selectivity gamit ang FragPipe computing platform nga gipadagan sa MSFragger.Ang mga cleavable linker gigamit sa Click chemistry aron tugutan ang photocleavage sa giusab nga mga peptide gikan sa streptavidin resin.Gilunsad ang usa ka bukas nga pagpangita aron mahibal-an ang daghang mga pagbag-o, ingon man ang may kalabutan nga mga salin.b I-assign ang masa sa mga kausaban nga nahitabo sa tibuok proteome.Peptide mapping PSM.c MS2 spectral annotation sa histidine sites giusab uban sa probe 3. Ingon sa usa ka representante nga panig-ingnan, usa ka covalent reaksyon uban sa probe 3 midugang +229.0938 Da sa giusab amino acid.d Mutation assay nga gigamit sa pagsulay sa PDPL marker.Ang PRDX3 (H155A, H225A) ug PRDX1 (H10A, H81A, H169A) gibalhin sa mga wild-type nga plasmids alang sa anti-Flag detection.e Ang sintetikong peptide gi-react sa purified miniSOG sa presensya sa probe 3 ug ang katugbang nga mga produkto nga adunay Δm +247 ug +229 nakit-an sa LC-MS spectrum.f In vitro protein-to-protein nga mga interaksyon nga gimodelo sa miniSOG-6xHis-tag ug anti-6xHis antibody.Antibiotin (streptavidin-HRP) ug anti-mouse Western blot analysis sa miniSOG-6xHis/anti-6xHis antibody complexes nga gimarkahan og probe 3, depende sa oras sa pagkaladlad sa kahayag.Ang mga label alang sa indibidwal nga mga protina gipahayag sa katugbang nga gibug-aton sa molekula: LC antibody light chain, HC antibody heavy chain.Kini nga mga eksperimento independente nga gisubli labing menos kaduha nga adunay parehas nga mga sangputanan.
Para sa biochemical verification sa labeling site, ang PRDX3 ug PRDX1 nga giila sa mass spectrometry giusab gikan sa histidine ngadto sa alanine ug itandi sa wild type sa transfection assays.Ang mga resulta sa PDPL nagpakita nga ang mutation sa kamahinungdanon pagkunhod sa labeling (Fig. 2d).Samtang, ang mga peptide sequence nga giila sa bukas nga pagpangita gi-synthesize ug gi-react in vitro nga adunay purified miniSOG sa presensya sa probe 3 ug asul nga kahayag, nga naghatag og mga produkto nga adunay mass shift nga +247 ug +229 Da sa dihang nakita sa LC-MS (Fig). .2e).).Aron masulayan kung ang mga interaksyon nga proximal nga mga protina mahimong markahan sa vitro agig tubag sa miniSOG photoactivation, nagdisenyo kami usa ka artipisyal nga kaduol nga assay pinaagi sa interaksyon tali sa miniSOG-6xHis nga protina ug usa ka anti-Iyang monoclonal antibody sa vitro (Figure 2f).Sa kini nga assay, gipaabut namon ang proximal nga pag-label sa antibody nga bug-at ug gaan nga kadena nga adunay miniSOG.Sa tinuud, ang anti-mouse (pag-ila sa bug-at ug gaan nga mga kadena sa anti-6xHis-labeled nga antibody) ug streptavidin Western blots nagpakita sa lig-on nga biotinylation sa bug-at ug gaan nga mga kadena.Ilabi na, among namatikdan ang miniSOG autobiotinylation tungod sa 6xHis tag ug cross-links tali sa gaan ug bug-at nga mga kadena, nga mahimong may kalabutan sa gihulagway kaniadto nga gintang tali sa lysine ug 2-oxo-histidine proximal nga tubag.Sa konklusyon, nakahinapos kami nga ang PDPL nag-usab sa histidine sa usa ka paagi nga nagsalig sa duol.
Ang among sunod nga katuyoan mao ang pag-ila sa subcellular proteome aron masulayan ang pagkatino sa pag-label sa in situ.Busa, lig-on namong gipahayag ang miniSOG sa nucleus, mitochondrial matrix, o outer ER membrane sa HEK293T cells (Fig. 3a).Ang pag-analisar sa fluorescence sa gel nagpadayag sa daghang mga marka nga mga banda sa tulo ka mga subcellular nga lokasyon ingon man usab sa lainlaing mga pattern sa pag-label (Fig. 3b).Ang fluorescence imaging analysis nagpakita sa taas nga espesipiko sa PDPL (Fig. 3c).Ang PDPL workflow gisundan sa pag-click nga mga reaksyon nga adunay rhodamine dyes aron i-delineate ang mga subcellular proteomes gamit ang fluorescence microscopy, ug ang mga signal sa PDPL gi-colocalized sa DAPI, mitochondrial trackers, o ER trackers, nga nagpamatuod sa taas nga fidelity sa PDPL.Alang sa tulo nga mga lokasyon sa organelle, ang usa ka kilid nga pagtandi sa PDPL sa TurboID gamit ang avidin western blot nagpakita nga ang PDPL gimarkahan nga labi ka espesipiko kung itandi sa ilang mga kontrol.Ubos sa mga kondisyon sa PDPL, mas daghan nga gimarkahan nga mga banda ang nagpakita, nga nagpakita sa daghang mga protina nga adunay label nga PDPL (Supplementary Fig. 6a-d).
usa ka eskematiko nga representasyon sa miniSOG-mediated organelle-specific proteome labeling.Gipunting sa miniSOG ang mitochondrial matrix pinaagi sa fusion sa N-terminal 23 amino acid sa tawo nga COX4 (mito-miniSOG), ang nucleus pinaagi sa fusion sa H2B (nucleus-miniSOG), ug Sec61β pinaagi sa cytoplasmic nga bahin sa ER membrane (ER-miniSOG). ).Ang mga timailhan naglakip sa gel imaging, confocal imaging, ug mass spectrometry.b Representative gel nga mga hulagway sa tulo ka organelle-specific PDPL profiles.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Representative confocal nga mga hulagway sa HEK293T nga mga selula nga lig-on nga nagpahayag sa miniSOG nga adunay lain-laing mga subcellular localization nga nakita sa antibody nga gimarkahan nga V5 (pula).Ang mga subcellular marker gigamit alang sa mitochondria ug ER (berde).Ang PDPL workflow naglakip sa detection sa miniSOG (yellow) nga adunay label nga subcellular proteomes gamit ang Cy3-azide click chemistry.Scale bar: 10 µm.d Volcanic plots sa PDPL-tag nga proteome sa nagkalain-laing organelles nga gi-quantified pinaagi sa unlabeled quantification (n = 3 independent biological experiments).Ang two-tailed Student's t-test gigamit sa mga plot sa bulkan.Ang HEK293T wild type gigamit isip negatibo nga kontrol. Ang makahuluganon nga pagbag-o nga mga protina gipasiugda sa pula (p <0.05 ug> 2-pilo nga kalainan sa intensity sa ion). Ang makahuluganon nga pagbag-o nga mga protina gipasiugda sa pula (p <0.05 ug> 2-pilo nga kalainan sa intensity sa ion). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Ang makahuluganon nga giusab nga mga protina gipasiugda sa pula (p <0.05 ug> 2-pilo nga kalainan sa intensity sa ion).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Mahinungdanon nga giusab nga mga protina gipasiugda sa pula (p <0.05 ug> 2-pilo nga kalainan sa kusog sa ionic).Ang mga may kalabotan nga protina nga hinungdanon alang sa HEK293T-miniSOG apan dili hinungdanon alang sa HEK293T gipakita sa berde.e Pagtuki sa espesipiko sa proteomic datasets gikan sa mga eksperimento d.Ang kinatibuk-ang gidaghanon sa mga mahinungdanon nga istatistikal nga mga protina sa matag organelle (pula ug berde nga mga tulbok) gimarkahan sa ibabaw.Ang histograms nagpakita sa mga protina nga na-localize sa mga organel base sa MitoCarta 3.0, GO analysis ug A. Ting et al.mga tawo.Pagbulag sa mga dataset alang sa mitochondria, nuclei, ug ER.Kini nga mga eksperimento independente nga gisubli labing menos kaduha nga adunay parehas nga mga sangputanan.Ang hilaw nga datos gihatag sa porma sa hilaw nga mga file sa datos.
Gidasig sa mga resulta sa gel ug imaging, ang walay label nga quantification gigamit sa pag-ihap sa giila nga proteome sa matag organelle (Supplementary Data 2).Ang wala mabalhin nga HEK293T gigamit ingon usa ka negatibo nga kontrol aron ibawas ang mga marka sa background. Ang pag-analisa sa laraw sa bulkan nagpakita sa labi nga gipadato nga mga protina (p <0.05 ug> 2-pilo nga intensity sa ion) ingon man mga singleton nga protina nga naa ra sa mga linya nga nagpahayag sa miniSOG (Fig. 3d nga pula ug berde nga tuldok). Ang pag-analisa sa laraw sa bulkan nagpakita sa labi nga gipadato nga mga protina (p <0.05 ug> 2-pilo nga intensity sa ion) ingon man mga singleton nga protina nga naa ra sa mga linya nga nagpahayag sa miniSOG (Fig. 3d nga pula ug berde nga tuldok). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Ang pag-analisa sa laraw sa bulkan nagpakita nga labi nga gipadato ang mga protina (p<0.05 ug> 2-fold nga intensity sa ion) ingon man ang mga single nga protina nga naa ra sa mga linya nga nagpahayag sa miniSOG (Fig. 3d, pula ug berde nga mga tulbok).火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 (P <0.05 和> 2 倍 离子 强度 在于 在于 在于 在于 在于 在于 的 的 的 绿色点 绿色点 绿色点).火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Ang pag-analisa sa laraw sa bulkan nagpadayag nga labi ka gipaayo nga mga protina (p<0.05 ug> 2x nga kusog sa ionic) ingon man ang mga single nga protina nga anaa lamang sa linya sa ekspresyon sa miniSOG (pula ug berde nga mga tulbok sa Fig. 3d).Ang paghiusa niini nga mga datos, among giila ang 1364, 461, ug 911 nga mahinungdanon nga istatistikal nga nukleyar, mitochondrial, ug ER nga mga protina sa gawas nga lamad, matag usa.Sa pag-analisar sa katukma sa organelle-localized PDPL, gigamit namo ang MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) analysis, ug A. Ting et al.usa ka data set8 ang gigamit alang sa mitochondria, nucleus, ug ER aron sulayan ang organelle specificity sa mga nakit-an nga protina, nga katumbas sa katukma sa 73.4, 78.5, ug 73.0% (Fig. 3e).Ang espesipiko sa PDPL nagpamatuod nga ang PDPL usa ka sulundon nga himan alang sa pag-ila sa mga proteome nga espesipiko sa organelle.Ilabi na, ang pag-analisa sa submitochondrial sa giila nga mga protina sa mitochondrial nagpakita nga ang natanggong nga proteome sa panguna giapod-apod sa matrix ug sulod nga lamad (226 ug 106, matag usa), nga nagkantidad sa 91.7% (362) sa kinatibuk-ang gidaghanon sa giila nga mga protina sa mitochondrial.ang usa ka taas nga lebel sa PDPL dugang gikumpirma (Supplementary Fig. 7a).Sa susama, ang subnuclear analysis nagpakita nga ang nakuha nga proteome nag-una nga giapod-apod sa nucleus, nucleoplasm, ug nucleolus (Supplementary Fig. 7b).Ang nukleyar nga proteomic analysis nga adunay nuclear localization signal peptide (3xNLS) nagpakita sa susama nga katukma sa H2B construct (Supplementary Fig. 7c-h).Aron mahibal-an ang espesipiko sa PDPL marker, ang nukleyar nga laminin A gipili isip usa ka mas discretely localized POI7 lit-ag.Giila sa PDPL ang 36 ka hinungdanon nga gipadato nga mga protina, diin ang 12 nga mga protina (30.0% lakip ang lamin A) maayo nga gihulagway nga lamin A nga mga interakting nga protina nga gi-annotate sa database sa String, nga adunay mas taas nga porsyento kaysa sa pamaagi sa BioID (122 nga mga protina) 28 sa 28. , 22.9 %) 7. Ang among pamaagi nag-ila sa mas gamay nga mga protina, posible tungod sa limitado nga mga lugar sa pag-label, nga nahimong posible pinaagi sa mas aktibo nga singlet nga oxygen.Ang pagtuki sa GO nagpakita nga ang giila nga mga protina kasagarang nahimutang sa nucleoplasm (26), nuclear membrane (10), nuclear membrane (9), ug nuclear pores (5).Sa kinatibuk-an, kini nga mga nukleyar nga lokal nga protina nag-asoy sa 80% sa gipadato nga mga protina, nga dugang nga nagpakita sa pagkatino sa PDPL (Supplementary Fig. 8a-d).
Sa pag-establisar sa katakus sa PDPL sa paghimo sa kaduol nga pagmarka sa mga organelles, among gisulayan kung ang PDPL mahimong magamit sa pag-analisar sa mga kasosyo nga nagbugkos sa POI.Sa partikular, gitinguha namon nga ipasabut ang pag-analisa sa PDPL sa mga cytosolic nga protina, nga gikonsiderar nga labi ka lisud nga mga target kaysa sa ilang mga katugbang nga na-localize sa lamad tungod sa ilang kusog kaayo nga kinaiya.Ang bromodomain ug extraterminal (BET) nga protina BRD4 nakadani sa among atensyon alang sa hinungdanon nga papel niini sa lainlaing mga sakit 35, 36.Ang complex nga naporma sa BRD4 usa ka transcriptional coactivator ug usa ka importante nga therapeutic target.Pinaagi sa pag-regulate sa ekspresyon sa c-myc ug Wnt5a transcription nga mga hinungdan, ang BRD4 gituohan nga usa ka yawe nga determinant sa acute myeloid leukemia (AML), multiple myeloma, Burkitt's lymphoma, colon cancer ug inflammatory disease37,38.Dugang pa, gitarget sa pipila ka mga virus ang BRD4 aron i-regulate ang viral ug cellular transcription, sama sa papillomavirus, HIV, ug SARS-CoV-236,39.
Aron mapa ang interaksyon sa BRD4 gamit ang PDPL, gihiusa namo ang miniSOG sa usa ka mubo nga N- o C-terminal isoform sa BRD4.Ang mga resulta sa proteomic nagpadayag sa usa ka taas nga lebel sa overlap tali sa duha ka mga konstruksyon (Supplementary Fig. 9a).Ang nukleyar nga proteome nga giila sa miniSOG-H2B naglangkob sa 77.6% sa mga protina nga nakig-uban sa BRD4 (Supplementary Fig. 9b).Dayon, ang nagkalainlain nga mga panahon sa paglamdag (2, 5, 10, 20 min) gigamit sa pag-adjust sa marker radius (Fig. 4a ug supplementary data 3).Naghinapos kami nga sa mas mugbo nga mga photoperiod, ang PDPL mag-una sa pag-label sa direktang mga kasosyo sa pagbugkos, samtang ang mas taas nga mga panahon maglakip sa mga protina nga giila sa mas mubo nga mga panahon sa photoactivation ingon man dili direkta nga mga target sa mga labeling complex.Sa pagkatinuod, nakit-an namo ang lig-on nga pagsapaw tali sa kasikbit nga mga punto sa oras (84.6% alang sa 2 ug 5 min; 87.7% alang sa 5 ug 10 min; 98.7% alang sa 10 ug 20 min) (Fig. 4b ug Supplementary Fig. 9c).Sa tanan nga mga eksperimento nga grupo, nakit-an namon dili lamang ang BRD4 nga pag-label sa kaugalingon, apan daghang nahibal-an nga mga target sama sa MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, ug HMGB1 nga gi-annotate sa database sa string.Ang ionic nga kusog niini nga mga target proporsyonal sa oras sa pagkaladlad (Fig. 4c ug Supplementary Fig. 9d).Ang pag-analisar sa GO sa mga protina nga giila sa 2-minuto nga grupo nagpakita nga ang giila nga mga protina na-localize sa nucleus ug nalambigit sa pag-remodel sa chromatin ug RNA polymerase function.Ang molecular function sa protina gipadato sa chromatin binding o transcriptional coactivation, nga nahiuyon sa BRD4 function (Fig. 4d).Ang string nga database-enabled protein interaction analysis nagpadayag sa unang lebel sa dili direkta nga interaksyon tali sa BRD4 ug HDAC family interacting complexes sama sa SIN3A, NCOR2, BCOR, ug SAP130 (Fig. 4e ug Supplementary Fig. 9e), nga nahiuyon sa BRD4 ug HDAC nga nagbugkos sa acetylated histones ..Dugang pa, ang mga target nga representante nga giila sa LC-MS / MS, lakip ang Sin3A, NSUN2, Fus, ug SFPQ, gikumpirma sa Western blotting (Fig. 4f).Bag-ohay lang, ang mubu nga isoform sa BRD4 gikataho nga nagporma og nuclei nga adunay mga kabtangan sa liquid-liquid phase separation (LLPS).Ang RNA binding proteins nga Fus ug SFPQ nagpataliwala sa LLPS sa lainlaing mga proseso sa cellular ug giila dinhi nga wala marekord nga BRD4 binding protein.Ang interaksyon tali sa BRD4 ug SFPQ gipamatud-an sa mga eksperimento sa co-immunoprecipitation (co-IP) (Figure 4g), nga nagsugyot og laing mekanismo alang sa BRD4-mediated liquid-liquid phase separation nga angayan sa dugang nga imbestigasyon.Gihiusa, kini nga mga resulta nagsugyot nga ang PDPL usa ka sulundon nga plataporma alang sa pag-ila sa nahibal-an nga nakig-uban sa BRD4 ingon man sa wala mailhi nga nagbugkos nga mga protina.
usa ka eskematiko nga representasyon sa miniSOG-mediated BRD4 proximity marking, exposure times: 2, 5, 10, ug 20 min.b Pagsapaw sa mga protina nga giila sa lain-laing mga panahon sa kahayag.Ang pagpauswag sa protina nga giila sa HEK293T-miniSOG-BRD4 hinungdanon sa istatistika kumpara sa wild-type nga HEK293T.c Ion intensity sa dihang nag-ihap sa wala'y label nga representante nga nailhan nga BRD4-binding nga mga protina atol sa gitakda nga oras sa pagkaladlad.n = 3 biologically independente nga mga sample.Gipresentar ang datos isip mean ± standard deviation.d Gene ontological analysis (GO) sa mga protina nga giila sa 2-minutos nga grupo.Gilista ang unang napulo ka termino sa GO.Ang mga bula gikoloran sumala sa GO term nga kategorya, ug ang gidak-on sa bula proporsyonal sa gidaghanon sa mga protina nga makita sa matag termino.e Pag-analisa sa string sa mga protina nga nakig-uban sa BRD4.Ang yellow nga mga lingin direkta nga glue ug ang gray nga mga lingin mao ang unang layer sa dili direkta nga glue.Ang pula nga mga linya nagrepresentar sa eksperimento nga gitino nga mga interaksyon ug ang asul nga mga linya nagrepresentar sa gitagna nga mga interaksyon.f Representante BRD4 binding target nga giila sa LC-MS/MS gipamatud-an pinaagi sa Western blotting.g Ang mga eksperimento sa co-immunoprecipitation nagpamatuod sa interaksyon tali sa SFPQ ug BRD4.Kini nga mga eksperimento independente nga gisubli labing menos kaduha nga adunay parehas nga mga sangputanan.Ang hilaw nga datos gihatag sa porma sa hilaw nga mga file sa datos.
Agi og dugang sa pag-ila sa dili rehistrado nga mga target nga may kalabotan sa POI, among gi-hypothesize nga ang PDPL mahimong angayan sa pag-ila sa mga substrate alang sa mga enzyme, nga magkinahanglan sa pag-ila sa dili direkta nga nagbugkos nga mga protina sa dagkong mga komplikado aron i-annotate ang dili rehistrado nga mga substrate.Ang Parkin (gi-encode sa PARK2) usa ka E3 ligase ug ang mga mutasyon sa parkin nahibal-an nga hinungdan sa autosomal recessive juvenile Parkinson's disease (AR-JP)42.Dugang pa, ang parkin gihulagway nga hinungdanon alang sa mitophagy (mitochondrial autophagy) ug pagtangtang sa mga reaktibo nga species sa oxygen.Bisan pa, bisan kung daghang mga substrate sa parkin ang nahibal-an, ang papel sa parkin sa kini nga sakit nagpabilin nga dili klaro.Aron i-annotate ang wala mailhi nga mga substrate niini, gisulayan ang PDPL pinaagi sa pagdugang sa miniSOG sa N- o C-terminus sa parkin.Ang mga selula gitambalan sa carbonyl cyanide proton transporter m-chlorophenylhydrazone (CCCP) aron ma-activate ang parkin pinaagi sa PINK1-Parkin nga agianan.Kung itandi sa among mga resulta sa BRD4 PDPL, ang parkin N-terminus fusion nagpadayag sa usa ka mas dako nga hugpong sa mga target nga protina, bisan kung kini naglangkob sa usa ka mas dako nga bahin sa C-terminus (177 gikan sa 210) (Figure 5a, b ug Supplementary Data 4).ang resulta nahiuyon sa mga taho nga ang mga tag sa N-terminal mahimong aberrant nga ma-aktibo ang Parkin44.Katingad-an, adunay 18 ra nga nag-overlap nga mga protina sa among datos nga adunay gipatik nga mga resulta sa AP-MS alang sa Parkin43, lagmit tungod sa mga kalainan tali sa mga linya sa cell ug mga proteomics workflows.Dugang pa sa upat ka nailhang protina (ARDM1, HSPA8, PSMD14, ug PSMC3) nga giila sa duha ka paagi (Fig. 5c)43.Aron mapamatud-an pa ang mga resulta sa LC-MS / MS, ang pagtambal sa PDPL ug ang sunod nga Western blotting gigamit aron itandi ang mga resulta sa HEK293T parent cell assay ug ang stable nga N-terminal parkin line.Kaniadto wala mailhi nga mga target CDK2, DUT, CTBP1, ug PSMC4 gisulayan sa usa ka nailhan nga binder, DNAJB1 (Fig. 5d).
Ang bulkan nga plot sa parkin-interacting nga mga protina sa HEK293T nga mga selula nga adunay lig-on nga gipahayag nga miniSOG nga gisagol sa N- o C-terminus sa parkin (n = 3 nga independente nga biological nga mga eksperimento).Ang two-tailed Student's t-test gigamit sa mga plot sa bulkan.Ang HEK293T gigamit isip negatibo nga kontrol. Ang makahuluganon nga pagbag-o nga mga protina gipasiugda sa pula (p <0.05 ug> 2-pilo nga kalainan sa intensity sa ion). Ang makahuluganon nga pagbag-o nga mga protina gipasiugda sa pula (p <0.05 ug> 2-pilo nga kalainan sa intensity sa ion). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Ang makahuluganon nga giusab nga mga protina gipasiugda sa pula (p <0.05 ug> 2-pilo nga kalainan sa intensity sa ion).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Mahinungdanon nga giusab nga mga protina gipasiugda sa pula (p <0.05 ug> 2-pilo nga kalainan sa kusog sa ionic).Ang mga may kalabotan nga protina nga hinungdanon alang sa HEK293T-miniSOG apan dili hinungdanon alang sa HEK293T gipakita sa berde.b Venn diagram nga nagpakita sa nagsapaw-sapaw nga mga protina tali sa N-terminal ug C-terminal constructs.Ang mga tag sa N-terminal mahimong aberrant nga makapaaktibo sa parkin ug moresulta sa mas mailhan nga mga protina.c Venn diagram nga nagpakita sa nagsapaw-sapaw nga mga protina tali sa PDPL ug AP-MS.Gilista ang mga nailhan nga interaktor, lakip ang 4 sa 18 nga nagsapaw-sapaw nga protina ug 11 sa 159 ka protina nga espesipikong giila sa PDPL.d Ang mga target nga representante nga giila sa LC-MS/MS gipamatud-an pinaagi sa Western blotting.e Ssu72 ug SNW1 giila nga dili rehistrado nga parkin substrates.Kini nga mga FLAG-tag nga protina plasmids gibalhin ngadto sa HEK293T ug HEK293T-Parkin-miniSOG nga gisundan sa CCCP nga pagtambal sa lainlaing mga punto sa oras.Ang pagkadaot labi nga gipahayag sa linya sa overexpression sa Parkin.f Gamit ang proteasome inhibitor MG132, gipamatud-an nga ang proseso sa pagkadaot sa Ssu72 ug SNW1 gipataliwad-an sa proteasome-ubiquitination.Kini nga mga eksperimento independente nga gisubli labing menos kaduha nga adunay parehas nga mga sangputanan.Ang hilaw nga datos gihatag sa porma sa hilaw nga mga file sa datos.
Ilabi na, ang mga protina nga giila sa PDPL kinahanglan nga maglakip sa mga protina nga nagbugkos sa parkin ug ang ilang mga substrate.Aron mahibal-an ang dili rehistrado nga mga substrate sa parkin, gipili namo ang pito nga giila nga mga protina (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 ug SNW1) ug gibalhin nga mga plasmid aron ibutyag kini nga mga gene sa normal nga HEK293T ug lig-on nga ipahayag ang HEK293T sa miniSOG-Parkin nga gisundan sa CCCP nga pagtambal.Ang lebel sa Ssu72 ug SNW1 nga mga protina gipakunhod pag-ayo sa stable nga linya sa miniSOG-Parkin (Fig. 5e).Ang pagtambal sa CCCP sulod sa 12 ka oras miresulta sa labing mahinungdanon nga pagkadaot sa duha ka substrates.Aron masusi kung ang pagkadaot sa Ssu72 ug SNW1 gikontrolar sa proteasome-ubiquitination, ang proteasome inhibitor MG132 gidugang aron pugngan ang kalihokan sa proteasome, ug sa tinuud nakit-an namon nga ang ilang proseso sa pagkadaot gipugngan (Fig. 5f).Ang mga dugang nga non-substrate nga mga target gikumpirma isip mga interaksyon sa Parkin gamit ang Western blotting (Supplementary Fig. 10), nga nagpakita sa makanunayon nga mga resulta sa LC-MS / MS.Sa konklusyon, ang paghiusa sa PDPL workflow nga adunay target nga transfection nga pag-verify sa protina nagtugot sa pag-ila sa dili rehistrado nga E3 ligase substrates.
Naghimo kami og usa ka komon nga plataporma sa pagmarka sa duol nga nagtugot kanimo sa pag-ila sa mga POI nga nag-interact sa wanang ug oras.Ang plataporma gibase sa miniSOG photosensitizer nga protina, nga mga 12 kDa lamang, ubos sa katunga sa gidak-on sa hamtong nga APEX2 enzyme (27 kDa) ug un-tersiya sa gidak-on sa TurboID (35 kDa).Ang mas gamay nga gidak-on kinahanglan nga mapalapad pag-ayo ang sakup sa mga aplikasyon alang sa pagtuon sa gagmay nga mga interaksyon sa protina.Ang dugang nga eksplorasyon sa dugang nga mga photosensitizer, bisan ang genetically encoded nga mga protina o gagmay nga mga molekula, gikinahanglan aron madugangan ang quantum yield sa singlet oxygen ug mapalapad ang pagkasensitibo niini nga pamaagi.Alang sa kasamtangan nga bersyon sa miniSOG, ang taas nga temporal nga resolusyon mahimong makab-ot gamit ang asul nga kahayag aron ma-aktibo ang mga marka sa duol.Dugang pa, ang mas taas nga oras sa pagkaladlad nagpagawas sa usa ka mas dako nga "panganod" sa singlet nga oxygen, nga miresulta sa pagbag-o sa mas distal nga histidine residues, dugang nga labeling radius, ug ang abilidad sa pag-ayo sa PDPL spatial resolution.Gisulayan usab namo ang pito ka kemikal nga probe aron madugangan ang ratio sa signal-to-background ug gisuhid ang mekanismo sa molekula luyo niini nga pamaagi.Ang TOP-ABPP workflow inubanan sa walay bias nga open search nagpamatuod nga ang mga kausaban nahitabo lamang sa histidines ug walay makanunayon nga microenvironment ang naobserbahan alang sa dugang nga histidine modifications, gawas sa kasarangang pagpalabi sa histidines sa loop nga rehiyon.
Gigamit usab ang PDPL aron mahibal-an ang mga subcellular proteome nga adunay espesipikong proteome ug pagsakup nga labing menos ikatandi sa uban nga pag-label sa duol ug mga pamaagi sa pagsusi sa kemikal nga piho sa organelle.Ang mga proximity marker malampuson usab nga gigamit aron mailhan ang nawong, lysosomal, ug mga proteome nga may kalabotan sa sekreto46,47.Kami nagtuo nga ang PDPL mahiuyon sa kini nga mga subcellular organelles.Dugang pa, gihagit namo ang PDPL pinaagi sa pag-ila sa mga target alang sa cytosolic protein binding nga mas komplikado kay sa membrane bound proteins tungod sa ilang dinamikong mga kabtangan ug pagkalambigit sa mas temporal nga mga interaksyon.Ang PDPL gipadapat sa duha ka protina, ang transcriptional coactivator BRD4 ug ang sakit nga nalangkit sa ligase E3 Parkin.Kini nga duha ka mga protina gipili dili lamang alang sa ilang sukaranan nga biolohikal nga mga gimbuhaton, apan alang usab sa ilang klinikal nga kalabotan ug potensyal sa pagtambal.Alang niining duha ka mga POI, nahibal-an ang mga ilado nga nagbugkos nga mga kauban ingon man ang wala marehistro nga mga target.Ilabi na, ang phase separation-associated protein SFPQ gikumpirma sa co-IP, nga mahimong nagpaila sa usa ka bag-ong mekanismo diin ang BRD4 (mubo nga isoform) nag-regulate sa LLPS.Sa samang higayon, nagtuo kami nga ang pag-ila sa mga substrate sa Parkin usa ka senaryo diin gikinahanglan ang pag-ila sa dili direkta nga mga adhesive.Gipaila namo ang duha ka wala mailhi nga mga substrate sa parkin ug gikumpirma ang ilang pagkadaot subay sa ubiquitination-proteasome nga agianan.Bag-ohay lang, usa ka pamaagi nga nakabase sa mekanismo sa pag-trap ang naugmad aron makit-an ang mga substrate sa hydrolase pinaagi sa pag-trap niini sa mga enzyme.Bisan kung kini usa ka kusgan kaayo nga pamaagi, dili kini angay alang sa pag-analisar sa mga substrate nga nahilambigit sa pagporma sa dagkong mga komplikado ug nanginahanglan pagporma sa mga covalent bond tali sa enzyme ug substrate.Gipaabut namon nga ang PDPL mahimong mapalapdan aron matun-an ang ubang mga komplikado nga protina ug mga pamilya sa enzyme, sama sa mga pamilya nga deubiquitinase ug metalloprotease.
Usa ka bag-ong porma sa miniSOG, gitawag nga SOPP3, naugmad uban ang gipaayo nga produksiyon sa singlet oxygen.Gikumpara namo ang miniSOG sa SOPP3 ug nakit-an ang mas maayo nga pagmarka sa performance, bisan pa ang signal-to-noise ratio nagpabilin nga wala mausab (Supplementary Fig. 11).Gipanghimatuud namon nga ang pag-optimize sa SOPP3 (pananglitan, pinaagi sa gimando nga ebolusyon) magdala sa labi ka episyente nga mga protina sa photosensitizer nga nanginahanglan labi ka mubu nga oras sa kahayag ug sa ingon gitugotan ang labi ka dinamikong mga proseso sa cellular nga makuha.Ilabi na, ang kasamtangan nga bersyon sa PDPL limitado sa cellular nga palibot tungod kay nagkinahanglan kini og asul nga kahayag nga kahayag ug dili makasulod sa lawom nga mga tisyu.Kini nga bahin nagpugong sa paggamit niini sa mga pagtuon sa modelo sa hayop.Bisan pa, ang kombinasyon sa optogenetics sa PDPL makahatag usa ka higayon alang sa panukiduki sa hayop, labi na sa utok.Dugang pa, ang ubang mga engineered infrared photosensitizer nagtangtang usab niini nga limitasyon.Ang panukiduki karon nagpadayon sa kini nga lugar.
Ang HEK293T cell line nakuha gikan sa ATCC (CRL-3216).Ang linya sa cell nagsulay negatibo alang sa impeksyon sa mycoplasma ug gikulata sa DMEM (Thermo, #C11995500BT) nga gidugangan sa 10% nga fetal bovine serum (FBS, Vistech, #SE100-B) ug 1% penicillin / streptomycin (Hyclone, #SV30010).mitubo sa.
Ang 3-Aminophenylene (sample 3) ug (4-ethynylphenyl)methanamine (sample 4) gipalit gikan sa Bidepharm.Ang propylamine (probe 2) gipalit gikan sa Energy-chemicals.Ang N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (probe 1) gi-synthesize sumala sa gipatik nga mga pamaagi.
Ang Supplementary Table 1 naglista sa genetic constructs nga gigamit niini nga pagtuon.Ang miniSOG ug KillerRed nga mga han-ay gi-clone gikan sa usa ka regalo nga plasmid gikan sa P. Zou (Peking University).Ang mitochondrial matrix targeting sequence nakuha gikan sa 23 N-terminal amino acids sa COX4 ug gi-clone sa gipakita nga mga vector gamit ang Gibson assembly (Beyotime, #D7010S).Aron matarget ang lamad ug nucleus sa endoplasmic reticulum, SEC61B human DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) nga gipadako sa PCR gikan sa cDNA library sa HEK293T nga mga selula, ug H2B DNA (gihatag ni D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) ug gi-clone, sama sa gihisgutan sa ibabaw.Gawas kung gipakita, ang ubang mga gen sa protina nga gigamit alang sa pagbalhin ug pagtukod sa mga lig-on nga linya sa cell gipadako sa PCR gikan sa HEK293T cell cDNA library.Ang G3S (GGGS) ug G4S (GGGGS) gigamit isip linkers tali sa bait protein ug miniSOG.Usa ka V5 epitope tag (GKPIPNPLLGLDST) ang gidugang niining mga fusion construct.Alang sa ekspresyon sa mga mammal ug aron magtukod usa ka lig-on nga linya sa cell, ang pagtukod sa miniSOG fusion gi-subclone sa pLX304 lentiviral vector.Para sa bacterial expression, ang miniSOG gi-clone sa pET21a vector nga gimarkahan og 6xHis sa C-terminus.
Ang HEK293T nga mga selula gisabwag sa 2.0 x 105 nga mga selula kada atabay sa unom ka atabay nga mga plato ug gibalhin 24 ka oras sa ulahi uban sa recombinant lentiviral plasmids (2.4 μg pLX304) ug viral packaging plasmids (1.5 μg psPAX2 ug 1.2 μg pMD2.G00) , #C0533), mga 80% fusion.Human sa tibuok gabii nga pagbalhin, ang medium giilisan ug gilumlom sa laing 24 ka oras.Ang pagkolekta sa virus gihimo pagkahuman sa 24, 48 ug 72 ka oras.Sa wala pa ang impeksyon sa mga linya sa target nga cell, ang viral medium gisala pinaagi sa usa ka 0.8 μm filter (Merck, #millex-GP) ug polybrene (Solarbio, #H8761) gidugang sa usa ka konsentrasyon nga 8 μg / ml.Human sa 24 ka oras, ang mga selula gitugotan sa pagbawi pinaagi sa pag-ilis sa medium.Ang mga selula gipili gamit ang 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) para sa unang tulo ka mga tudling isip ubos nga higpit nga pagpili.Dayon gigamit ang 20 μg/ml isip mas estrikto nga regimen para sa sunod nga tulo ka tudling.
Ang mga selyula gisabod sa 12-well chambers (Ibidi, #81201) sa densidad nga gibana-bana nga 20,000 ka mga selula kada atabay.Aron mapalambo ang pagdikit sa HEK293T cells, idugang ang 50 µg/ml fibronectin (Corning, #356008) nga lasaw sa phosphate buffered saline (PBS, Sangon, #B640435) sa 37°C.Ang mga lawak pretreated sulod sa 1 ka oras ug dayon gikuha sa PBS.Pagkahuman sa 24 ka oras, ang mga selyula gihugasan kausa sa PBS, gilumlom sa 1 mM probe 3 sa bag-ong balanse nga solusyon sa asin sa Hanks (HBSS, Gibco, #14025092) sa 1 ka oras sa 37 ° C, ug dayon gilubog sa usa ka asul nga LED (460 nm ).) gi-irradiated sulod sa 10 min sa temperatura sa lawak.Human niana, ang mga selula gihugasan kaduha sa PBS ug giayo sa 4% formaldehyde sa PBS (Sangon, #E672002) sulod sa 15 minutos sa temperatura sa lawak.Ang sobra nga formaldehyde gikuha gikan sa mga fixed cell pinaagi sa paghugas sa tulo ka beses gamit ang PBS.Ang mga selula dayon permeabilized sa 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) sa PBS ug gihugasan 3 ka beses sa PBS.Dayon kuhaa ang chamber ug idugang sa matag sample ang 25 µl sa usa ka click reaction mixture nga adunay 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) ug 0.5 mg/ml sodium ascorbate (Aladdin, no. S105024) ug gilumlom sa 30 minutos sa temperatura sa lawak.Human sa usa ka snap reaction, ang mga selula gihugasan unom ka beses sa PBS nga adunay sulod nga 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) ug dayon gibabagan sa 5% BSA (Abcone, #B24726) sa PBST sulod sa 30 minutos sa temperatura sa lawak.
Alang sa immunostaining sa colocalization, ang mga selyula gipalumlom sa panguna nga mga antibodies sumala sa gipakita nga mga kondisyon: mouse anti-V5 tag mAb (1: 500, CST, #80076), rabbit anti-Hsp60 mAb (1: 1000), ABclonal, #A0564), rabbit polyclonal anti-calnexin antibody (1:500, Abcam, #ab22595) o rabbit anti-lamin A/C monoclonal antibody (1:500; CST, #2032) sa 4 °C sa tibuok gabii.Human sa paghugas sa 3 ka beses sa PBST, ang mga selyula gilumlom sa secondary antibodies: kanding anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) lasaw 1:1000, kanding anti-mouse Alexa Fluor 594 (CST, #8889) lasaw 1:1000.dilution Dilute sa lawak nga temperatura alang sa 30 minutos.Ang mga selula dayon gihugasan 3 ka beses sa PBST ug gi-counterstain sa DAPI (Thermo, #D1306) sa PBS sulod sa 10 ka minuto sa temperatura sa lawak.Pagkahuman sa 3 nga paghugas gamit ang PBS, ang mga selyula giselyohan sa 50% nga glycerol (Sangon, # A600232) sa PBS alang sa imaging.Ang immunofluorescent nga mga hulagway nakuha gamit ang ZEISS LSM 900 Airyscan2 confocal microscope ug ZNE 3.5 software.
Alang sa singlet oxygen fluorescent imaging, ang mga selyula gihugasan kaduha gamit ang Hanks HEPES buffer sa wala pa idugang ang 100 nM Si-DMA sa Hanks HEPES buffer (DOJINDO, #MT05).Human sa pagkaladlad sa kahayag, ang mga selula gilumlom sa usa ka CO2 incubator sa 37 ° C sulod sa 45 minutos.Ang mga selyula dayon gihugasan kaduha gamit ang Hanks' HEPES buffer ug gi-counterstain sa Hoechst sa Hanks' HEPES buffer sulod sa 10 minutos sa temperatura sa lawak ug makita gamit ang ZEISS LSM 900 confocal microscope., #M36008) sa HBSS buffer nga adunay calcium ug magnesium.Human sa pagkaladlad sa kahayag o doxorubicin (MCE, #HY-15142A), ang mga selula gilumlom sa usa ka CO2 incubator sa 37 ° C. sulod sa 10 minutos, gihugasan kaduha sa HBSS buffer, ug gilumlom sa Hoechst sa HBSS buffer sa temperatura sa lawak.minuto.Ang Doxorubicin gigamit isip usa ka positibo nga kontrol sa pagsusi diin ang mga selula gitambalan sa 20 μM doxorubicin sa HBSS nga adunay 1% BSA sulod sa 30 min.Ang immunofluorescent nga mga hulagway nakuha gamit ang Zeiss LSM 900 confocal microscope.
Ang HEK293T nga mga selula nga lig-on nga nagpahayag sa mito-miniSOG gipugas sa densidad nga gibana-bana nga 30% sa 15 cm nga mga pinggan.Pagkahuman sa 48 ka oras, kung naabot ang ~ 80% nga panagsama, ang mga selyula gihugasan kausa sa PBS, gilumlom sa 1 mM Probe 3 sa presko nga HBSS buffer sa 1 oras sa 37 ° C ug dayon gipasiga sa usa ka asul nga LED sa 10 minuto sa kwarto temperatura..Pagkahuman, ang mga selyula gihugasan kaduha gamit ang PBS, gi-scrap ug gisuspinde sa bugnaw nga PBS buffer nga adunay sulud nga EDTA-free protease inhibitors (MCE, #HY-K0011).Ang mga cell gi-lysed pinaagi sa pag-sonicate sa tip sa 1 minuto (1 segundo sa ug 1 segundo sa 35% nga amplitude).Ang resulta nga sagol gi-centrifuged sa 15,871 xg alang sa 10 min sa 4 ° C aron makuha ang mga tinumpag, ug ang supernatant nga konsentrasyon gi-adjust sa 4 mg / mL gamit ang BCA protein assay kit (Beyotime, #P0009).Isagol ang 1 ml sa ibabaw nga lysate nga adunay 0.1 mM photodegradable biotin azide (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA ligand (Aladdin, #T162437), ug 1 mM CuSO4 incubator pag-rotate sa 1 ka oras sa temperatura sa kwarto.Human sa usa ka snap reaction, idugang ang sagol sa pre-mixed solution (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) sa 10 ml nga glass vial.Ang mga sample gisagol ug gi-centrifuged sa 4500 g sa 10 minuto sa temperatura sa kwarto.Ang ubos ug taas nga mga solusyon gilabay, ang precipitate gihugasan kaduha sa 1 ml nga methanol ug gi-centrifuge sa 15871 × g sulod sa 5 min sa 4 ° C.Idugang ang 1 ml sa 8 M urea (Aladdin, no. U111902) sa 25 mM ammonium bicarbonate (ABC, Aladdin, no. A110539) aron matunaw ang precipitate.Ang mga sample gi-reconstituted sa 10 mM dithiothreitol (Sangon, # A100281 sa 25 mM ABC) sulod sa 40 minutos sa 55 ° C nga gisundan sa pagdugang sa 15 mM nga lab-as nga iodoacetamide (Sangon, # A600539) sa temperatura sa lawak sa kangitngit.Alkylation sulod sa 30 minutos..Ang dugang nga 5 mM dithiothreitol gidugang aron mapahunong ang reaksyon.Pag-andam ug gibana-bana nga 100 µl NeutrAvidin agarose beads (Thermo, #29202) para sa matag sample pinaagi sa paghugas sa 3 ka beses gamit ang 1 ml PBS.Ang labaw sa proteome nga solusyon lasaw sa 5 ml PBS ug gilumlom sa pre-hugasan nga NeutrAvidin agarose beads sulod sa 4 ka oras sa temperatura sa lawak.Ang mga lubid dayon gihugasan 3 ka beses sa 5 ml PBS nga adunay 0.2% SDS (Sangon, #A600485), 3 ka beses sa 5 ml PBS nga adunay 1M urea, ug 3 ka beses sa 5 ml ddH2O.Ang mga lubid dayon ani pinaagi sa centrifugation ug gisuspinde sa 200 μl sa 25 mM ABC nga adunay sulod nga 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) ug 20 ng / μl trypsin (Promega, #V5280).Trypsinize sa tibuok gabii sa 37°C nga may rotation.Ang reaksyon gipahunong pinaagi sa pagdugang sa formic acid (Thermo, # A117-50) hangtod ang pH moabot sa 2-3.Ang mga lubid gihugasan 3 ka beses nga adunay 1 ml nga PBS nga adunay 0.2% SDS, 3 ka beses nga adunay 1 ml nga PBS nga adunay 1 M urea, ug dayon 3 ka beses sa 1 ml nga distilled water.Ang giusab nga mga peptide gipagawas sa light lysis (365 nm) alang sa 90 min gamit ang 200 μl sa 70% MeOH.Human sa centrifugation, ang supernatant gikolekta.Ang mga beads dayon gihugasan kausa sa 100 μl sa 70% MeOH ug ang mga supernatant gipundok.Ang mga sample gipauga sa usa ka Speedvac vacuum concentrator ug gitipigan sa -20 ° C hangtod sa pagtuki.
Sa pag-ila ug pag-ihap sa singlet nga oxygen nga nabag-o nga peptides, ang mga sample gi-redissolved sa 0.1% formic acid ug 1 μg sa peptides ang gi-analisa gamit ang Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer nga adunay nano ESI nga tinubdan gikan sa Tune ug Xcalibur gikan sa vendor software 4.3.Ang mga sample gibulag sa usa ka 75 µm × 15 cm internally packed capillary column nga adunay 3 µm C18 nga materyal (ReproSil-pur, #r13.b9.) ug konektado sa usa ka EASY-nLC 1200 UHPLC system (Thermo).Ang mga peptide gibulag pinaagi sa linear 95 minuto nga gradient chromatography gikan sa 8% solvent B ngadto sa 50% solvent B (A = 0.1% formic acid sa tubig, B = 0.1% formic acid sa 80% acetonitrile), unya linearly misaka ngadto sa 98% B min. sa 6 min sa usa ka flow rate nga 300 nl/min.Ang Orbitrap Fusion Lumos nag-ilis sa mga datos tali sa tibuok MS scan ug MS2 scan depende sa datos.Ang sputtering boltahe gibutang sa 2.1 kV ug ang temperatura sa ion transport capillary mao ang 320 ° C.Ang MS spectra (350-2000 m/z) nakolekta nga adunay resolusyon nga 120,000, AGC 4 × 105, ug maximum input time nga 150 ms.Ang 10 ka kasagarang multiply charged precursors sa matag bug-os nga pag-scan gibahin gamit ang HCD nga adunay normal nga collision energy nga 30%, quadrupole isolation window nga 1.6 m/z, ug resolution setting nga 30,000.Usa ka target sa AGC alang sa tandem mass spectrometry gamit ang 5 × 104 ug maximum nga oras sa pag-input 150 ms.Ang dinamikong eksepsiyon gitakda sa 30 segundos. Ang wala ma-assign nga mga ion o kadtong adunay bayad nga 1+ ug> 7+ gisalikway alang sa MS/MS. Ang wala ma-assign nga mga ion o kadtong adunay bayad nga 1+ ug> 7+ gisalikway alang sa MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ang wala ma-assign nga mga ion o mga ion nga adunay bayad nga 1+ ug> 7+ gisalikway alang sa MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ ug >7+ были отклонены для МС/МС. Ang wala matino nga mga ion o mga ion nga adunay mga singil nga 1+ ug> 7+ gisalikway alang sa MS/MS.
Ang hilaw nga datos giproseso gamit ang FragPipe computing platform base sa MSFragger.Ang mass biases ug katugbang nga amino acids gitino gamit ang open search algorithm nga adunay precursor mass tolerance nga -150 ngadto sa 500 Da.Ang nabag-o nga mga peptide dayon giila gamit ang mga pagbag-o sa histidine nga adunay mass gains nga +229.0964 ug +247.1069 Da sa PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Ang mga selula nga lig-on nga nagpahayag sa gisagol nga miniSOG nga gene giputos sa 6 cm nga mga pinggan.Sa pag-abot sa ~ 80% nga panagtagbo, ang mga selula gihugasan kausa sa HBSS (Gibco, #14025092), dayon gilumlom sa kemikal nga mga pagsusi sa HBSS sulod sa 1 ka oras sa 37 ° C ug gilamdagan sa asul nga kahayag.10W LED alang sa 20 minuto sa temperatura sa kwarto.Aron mahibal-an kung unsang klase sa reactive oxygen species ang naapil sa PDPL, 0.5 mM bitamina C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), Ang 100 mM mannitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 gidugang sa mga selula isip mga suplemento.Human sa paghugas sa bugnaw nga PBS, ang mga selula gikiskis, gikolekta sa 1.5 ml centrifuge tubes, ug sonicated sa usa ka tip alang sa 1 min sa 200 μl sa PBS nga adunay 1x protease inhibitor nga walay EDTA (1 s ug 1 s nga walay, amplitude 35%).Ang resulta nga sagol gi-centrifuged sa 15,871 × g alang sa 10 min sa 4 ° C ug ang supernatant nga konsentrasyon gi-adjust sa 1 mg / mL gamit ang BCA protein assay kit.Gibana-bana nga 50 µl sa lysate sa ibabaw gilumlom sa 0.1 mM rhodamine azide (Aladdin, no. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, ug 1 mM CuSO4 sulod sa 1 ka oras sa temperatura sa lawak nga adunay rotation gikan sa ubos ngadto sa ibabaw.Pagkahuman sa reaksyon sa pag-click, ang pag-ulan nga adunay acetone gihimo pinaagi sa pagdugang sa 250 μl nga pre-chilled acetone sa mga sample, paglumlum sa -20 ° C sa 20 min ug centrifuging sa 6010 × g sa 10 min sa 4 ° C.Kolektaha ang pellet ug pabukala sa 50 µl sa 1x Laemmli's buffer sulod sa 10 min sa 95 °C.Gisusi dayon ang mga sample sa SDS-PAGE nga taas nga mga gel ug gihulagway gamit ang Bio-rad ChemiDoc MP Touch imaging system nga adunay Image Lab Touch software.
Ang pagpahayag ug pagputli sa recombinant nga miniSOG-6xHis nga protina gihimo sama sa gihulagway kaniadto.Sa laktud, ang E. coli BL21 (DE3) nga mga selula (TransGen, # CD701-02) giusab sa pET21a-miniSOG-6xHis ug ang ekspresyon sa protina gipahinabo sa 0.5 mM IPTG (Sangon, # A600168).Human sa cell lysis, ang mga protina giputli gamit ang Ni-NTA agarose beads (MCE, no. 70666), gi-dialyze batok sa PBS, ug gitipigan sa -80 ° C.
Para sa antibody-based in vitro label proximity assay, isagol ang 100 μM purified miniSOG, 1 mM probe 3, ug 1 μg anti-label mouse monoclonal antibody (TransGen, #HT501-01) sa PBS ngadto sa total reaction volume nga 50 μl..Ang sagol nga reaksyon gi-irradiated sa asul nga LED nga suga alang sa 0, 2, 5, 10, ug 20 min sa temperatura sa kwarto.Ang sagol nga gilumlom sa 0.1 mM biotin-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, ug 1 mM CuSO4 sulod sa 1 h sa temperatura sa lawak sa usa ka upward motion shaker.Human sa usa ka snap reaction, idugang ang 4x Laemmli's buffer direkta sa sagol ug pabukala sa 95°C sulod sa 10 min.Ang mga sample gisusi sa SDS-PAGE gels ug gisusi pinaagi sa western blotting nga adunay streptavidin-HRP (1: 1000, Solarbio, #SE068).
Usa ka histidine nga adunay sulud nga sintetikong peptide nga adunay C-terminal amidation (LHDALDAK-CONH2) gigamit sa pag-analisar sa duol nga peptide-based in vitro labeling.Niini nga assay, ang 100 μM nga giputli nga miniSOG, 10 mM probe 3 ug 2 μg / ml nga sintetikong peptide gisagol sa PBS sa kinatibuk-ang gidaghanon sa reaksyon nga 50 μl.Ang sagol nga reaksyon gi-irradiated sa asul nga LED nga suga sulod sa 1 ka oras sa temperatura sa kwarto.Usa ka microliter sa sample ang gisusi gamit ang LC-MS system (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight mass spectrometer nga adunay MassLynx spectrum analysis software).
Ang HEK293T nga mga selula nga lig-on nga nagpahayag sa miniSOG fusion gene gipugas sa 10 cm nga mga pinggan alang sa mga linya nga adunay lainlaing organelle localization (Mito, ER, Nucleus) ug 15 cm nga mga pinggan alang sa Parkin-miniSOG ug BRD4-miniSOG nga mga linya.Sa pag-abot sa ~ 90% nga panagtagbo, ang mga selyula gihugasan kausa sa HBSS, dayon gilumlom sa probe 3 sa HBSS sulod sa 1 ka oras sa 37 ° C ug gipadan-ag sa usa ka 10 W blue LED sa temperatura sa lawak.Para sa non-contact labeling sa Parkin, 10 µM proton carbonyl cyanide carrier m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) nga adunay probe 3 sa HBSS gidugang sulod sa 1 ka oras sa 37°C.Ang cell lysis, click chemistry, reduction ug alkylation nga mga lakang parehas sa gihulagway sa ibabaw, gawas nga ang 2 mg sa lysate gidugang ug biotin PEG3 azide gigamit sa click reaction imbes sa photodegradable biotin azide.Human sa pagpalambo, ang mga lubid gihugasan 3 ka beses nga adunay 5 ml nga PBS nga adunay 0.2% nga SDS, 3 ka beses nga adunay 5 ml nga PBS nga adunay 1 M urea, ug 3 ka beses nga adunay 5 ml nga PBS.Pagkahuman, ang 2 µg trypsin gidugang sa 300 µl 25 mM ABC nga adunay sulud nga 1 M urea aron mabuak ang protina sa tibuok gabii sa 37 ° C.Ang reaksyon gipahunong pinaagi sa pagdugang sa formic acid hangtod ang pH nga 2-3 naabot.Human sa trypsinization sa beads, ang peptide nga solusyon gi-desalted gamit ang SOLAµ HRP column (Thermo, #60209-001) ug gipauga sa Speedvac vacuum concentrator.Ang mga peptide gi-redissolved sa 0.1% formic acid ug 500 ng sa peptides ang gi-analisa gamit ang Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer nga nasangkapan sa nano-ESI nga tinubdan nga gihulagway sa ibabaw.Ang mga peptide gibulag sa komersyal nga RP-HPLC precolumns (75 μm x 2 cm) (Thermo, no. 164946) ug analytical RP-HPLC columns (75 μm x 25 cm) (Thermo, no. 164941), parehong puno sa 2 μm.gradient gikan sa 8% ngadto sa 35% ACN sa 60 minutos, unya linearly misaka ngadto sa 98% B sa 6 minutos sa usa ka dagan rate sa 300 Nl/min.Ang MS spectra (350-1500 m/z) nakolekta nga adunay resolusyon nga 60,000, AGC 4 × 105, ug maximum input time nga 50 ms.Ang pinili nga mga ion sunodsunod nga gibahin sa HCD sa 3 s nga mga siklo nga adunay normal nga kusog sa pagbangga nga 30%, usa ka quadrupole isolation window nga 1.6 m / z, ug usa ka resolusyon nga 15000. Usa ka 5 × 104 tandem mass spectrometer AGC nga target ug usa ka maximum nga oras sa pag-injection sa 22 ms gigamit.Ang dinamikong pagtangtang gitakda sa 45 segundos. Ang wala ma-assign nga mga ion o kadtong adunay bayad nga 1+ ug> 7+ gisalikway alang sa MS/MS. Ang wala ma-assign nga mga ion o kadtong adunay bayad nga 1+ ug> 7+ gisalikway alang sa MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ang wala ma-assign nga mga ion o mga ion nga adunay bayad nga 1+ ug> 7+ gisalikway alang sa MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ ug >7+ были отклонены для МС/МС. Ang wala matino nga mga ion o mga ion nga adunay mga singil nga 1+ ug> 7+ gisalikway alang sa MS/MS.
Ang mga lakang sa pag-andam sa sample hangtod sa pagpauswag sa mga lubid nga NeutrAvidin parehas sa pagtuki sa LC-MS / MS nga gihulagway sa ibabaw.Gibana-bana nga 50 μg sa lysate ang gigamit isip input para sa loading control ug 2 mg sa lysate gigamit para sa click reactions.Human sa pagpalambo ug paghugas sa neutravidin, ang gigapos nga mga protina gi-eluted pinaagi sa pagdugang sa 50 μl sa Laemmli's buffer ngadto sa agarose resin beads ug pagpabukal sa 95 ° C. sulod sa 5 minutos.Control load input ug bead enriched samples gisusi sa SDS-PAGE ug gibalhin ngadto sa PVDF membranes (Millipore, #ISEQ00010) pinaagi sa standard Western blot nga mga pamaagi.Ang mga lamad gibabagan sa 5% nga skim milk (Sangon, #A600669) sa TBS nga adunay sulod nga 0.1% tween-20 (TBST) ug giluom nga sunud-sunod sa panguna ug sekondaryang antibodies.Ang mga nag-unang antibodies natunaw sa 1: 1000 sa 5% nga skim nga gatas sa TBST ug gilumlom sa tibuok gabii sa 4 ° C.Ang ikaduha nga mga antibodies gigamit sa usa ka ratio nga 1: 5000 ug gilumlum sulod sa 1 ka oras sa temperatura sa lawak.Ang mga lamad gihulagway pinaagi sa chemiluminescence gamit ang Chemidoc MP imaging system.Ang tanan nga wala maputol nga pag-scan sa mga blots ug gel sa numero gipresentar isip hilaw nga datos.
Ang mga nag-unang antibodies nga gigamit niini nga pagtuon naglakip sa rabbit anti-SFPQ monoclonal antibody (CST, no. 71992), rabbit anti-FUS monoclonal antibody (CST, no. 67840), rabbit anti-NSUN2 polyclonal antibody (Proteintech, no. 20854-1- AP), rabbit anti-mSin3A polyclonal antibody (Abcam, #ab3479), mouse anti-tag monoclonal antibody (TransGen, #HT201-02), mouse anti-β-actin monoclonal antibody (TransGen, #HC201-01), rabbit anti -CDK2 monoclonal antibody (ABclonal, #A0094), rabbit monoclonal antibody sa CTBP1 (ABclonal, #A11600), rabbit polyclonal antibody sa DUT (ABclonal, #A2901), rabbit polyclonal antibody sa PSMC4 (ABclonal, #A2505), rabbit anti-A2505 DNAJB1 polyclonal antibody (ABclonal, # A5504).Kini nga mga antibodies gigamit sa usa ka 1: 1000 dilution sa 5% nga skim milk sa TBST.Ang ikaduhang antibodies nga gigamit niini nga pagtuon naglakip sa anti-rabbit IgG (TransGen, #HS101-01), anti-mouse IgG (TransGen, #HS201-01) sa 1:5000 dilution.
Aron masusi pa kung nakig-interact ba ang BRD4 sa SFPQ, ang mga stable nga HEK293T ug BRD4-miniSOG nga mga selyula nga nag-overexpress sa HEK293T gibutang sa 10 cm nga pinggan.Ang mga selula gihugasan sa bugnaw nga PBS ug gi-lysed sa 1 ml Pierce IP lysis buffer (Thermo Fisher, #87787) nga adunay EDTA-free protease inhibitor sulod sa 30 minutos sa 4 ° C.Pagkahuman niana, ang mga lysate gikolekta sa 1.5 ml nga mga tubo sa centrifuge ug gi-centrifuged sa 15,871 xg sa 10 min sa 4 ° C.Ang supernatant giani ug gilumlom sa 5 µg nga anti-V5 nga gimarkahan nga mouse monoclonal antibody (CST, #80076) sa tibuok gabii sa 4°C.Hugasi ang gibana-bana nga 50 µl sa protina A/G magnetic beads (MCE, #HY-K0202) kaduha gamit ang PBS nga adunay 0.5% Tween-20.Dayon ang mga cell lysates gilumlom sa magnetic beads sulod sa 4 ka oras sa 4 ° C nga adunay rotation gikan sa ubos ngadto sa ibabaw.Dayon ang mga lubid gihugasan upat ka beses sa 1 ml sa PBST buffer ug gilat-an sa 95 ° C sulod sa 5 min.Ang mga sample gi-analisa sa SDS-PAGE gels ug gibalhin sa PVDF membranes gamit ang standard Western blot method.Ang mga lamad gibabagan sa 5% nga skim milk sa TBST ug sunodsunod nga gilumlom sa panguna ug sekondaryang antibodies.Ang Primary Antibody Rabbit anti-SFPQ monoclonal antibody (CST, #71992) gigamit sa ratio nga 1:1000 sa 5% nga skim milk sa TBST ug gilumlom sa tibuok gabii sa 4°C.Ang anti-rabbit IgG gigamit sa ratio nga 1:5000 ug gilumlum sulod sa 1 ka oras sa temperatura sa lawak.Ang mga lamad gihulagway pinaagi sa chemiluminescence gamit ang Chemidoc MP imaging system.
Ang tanan nga mga istruktura nga gigamit alang sa pagtuki sa Solvent Accessible Surface Area (SASA) nakuha gikan sa Protein Data Bank (PDB)52 o ang AlphaFold Protein Structure Database53.Ang hingpit nga SASA gikalkulo alang sa matag nahabilin gamit ang FreeSASA nga programa.Ang kompleto ug dili klaro nga datos sa SASA alang sa gimarkahan nga histidine ug mga silingan niini ang gigamit aron makuha ang mean nga SASA alang sa matag istruktura.Ang relatibong solvent accessibility (RSA) alang sa matag histidine gikalkulo pinaagi sa pagbahin sa hingpit nga SASA nga bili sa empirical nga maximum nga posible nga residue surface area nga anaa sa solvent.Ang tanan nga histidines dayon giklasipikar nga gitago kung ang mean RSA ubos sa 20%, kung dili mabutyag56.
Ang mga hilaw nga file nga nakuha sa DDA mode gipangita gamit ang Proteome Discoverer (v2.5) o MSfragger (Fragpipe v15.0) sa angay nga SwissProt verified protein database nga adunay komon nga mga kontaminante.Ang mga peptide nanginahanglan kompleto nga trypsin nga adunay duha nga nawala nga mga cleavage site, ang carbamoyl methylation ingon usa ka pirmi nga pagbag-o ug ang oksihenasyon sa methionine ingon usa ka dinamikong pagbag-o.Ang precursor ug fragment weight tolerances gitakda sa 10 ppm ug 0.02 Da (MS2 Orbitrap), matag usa. Gikuha ang mga kontaminant hits, ug ang mga protina gisala aron makakuha og sayop nga rate sa pagkadiskobre nga <1%. Gikuha ang mga kontaminant hits, ug ang mga protina gisala aron makakuha og sayop nga rate sa pagkadiskobre nga <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложного %. Gikuha ang mga kontaminant hits ug gisala ang mga protina aron mahatagan ang sayup nga rate sa pagkakita nga <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаруже%. Gikuha ang mga kontaminant hits ug gisala ang mga protina aron makab-ot ang sayup nga positibo nga rate nga <1%.Alang sa quantitative analysis nga walay paggamit sa mga label, gigamit ang normalized protein content gikan sa tulo ka biological repeats.Ang pagtuki sa subcellular localization sa protina gihimo gamit ang Gene Ontology (GO) analysis gikan sa DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 ug mga database nga gihugpong ug gipatik sa grupong Alice Ting.Ang mapa sa bulkan nakuha gikan kang Perseus (v1.6.15.0). Ang mga pagbag-o sa abundance fold sa protina gisulayan alang sa statistical significance gamit ang two-sided t-test, ug ang mga hit sa protina giila nga adunay abundance change> 2 (gawas kon gipahayag) ug p value <0.05. Ang mga pagbag-o sa abundance fold sa protina gisulayan alang sa statistical significance gamit ang two-sided t-test, ug ang mga hit sa protina giila nga adunay abundance change> 2 (gawas kon gipahayag) ug p value <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Ang mga pagbag-o sa sulud sa sulud sa protina gisulayan alang sa istatistikal nga kahulogan gamit ang usa ka two-tailed t-test, ug ang mga tugma sa protina giila nga adunay pagbag-o sa sulud> 2 (gawas kung nahibal-an) ug ap nga kantidad <0.05.使用使用 T 检验 测试 丰度 倍数 变化 的 统计统计, 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 (除非 另 有 说明) 和 p 值 <0.05.使用使用 T 检验 测试 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 (另 有 说明) 和 p 值 <0.05. Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Ang estadistika nga kahulogan sa mga pagbag-o sa fold sa sulod sa protina gisulayan gamit ang usa ka two-tailed t-test, ug ang mga tugma sa protina gitino alang sa mga kausaban sa sulod> 2 (gawas kon gipakita) ug p-values <0.05.Ang pag-analisar sa interaksyon sa protina gihimo gamit ang pagtuki sa GO kauban ang database sa String.
Tulo ka biolohikal nga mga replika ang gihimo nga adunay parehas nga mga sangputanan.Ang pagtuki sa estadistika gihimo gamit ang GraphPad Prism (GraphPad software) ug ang mga laraw sa bulkan gihimo gamit ang Perseus (v1.6.15.0).Aron itandi ang duha ka grupo, ang p-values gideterminar gamit ang two-tailed Student's t-test.Ang mga singleton nga protina lamang nga giila nga labing menos kaduha sa eksperimento nga grupo ang gilakip sa mga laraw sa bulkan, ug ang katugbang nga nawala nga mga kantidad sa kontrol nga grupo gipulihan sa Perseus gikan sa usa ka normal nga pag-apod-apod aron ang p-value makalkulo.Ang mga error bar nagrepresentar sa mean ± standard deviation.Sa proteomic analysis alang sa statistical analysis, ang kadagaya sa mga protina nga nagpakita sa labing menos duha ka biological replicates gipabilin.Ang mga pamaagi sa estadistika wala gigamit sa pagtino daan sa gidak-on sa sample.Ang mga eksperimento dili basta-basta.Ang mga tigdukiduki dili buta sa mga buluhaton sa panahon sa eksperimento ug pagtimbang-timbang sa mga resulta.
Alang sa dugang nga kasayuran sa disenyo sa pagtuon, tan-awa ang abstract sa Nature Research Report nga nalambigit niini nga artikulo.
Ang datos sa mass spectrometry nga nakuha niini nga pagtuon gisumite sa ProteomeXchange Consortium pinaagi sa iProX57 partner repository ubos sa dataset ID PXD034811 (PDPL-MS dataset).Ang hilaw nga datos gihatag sa porma sa hilaw nga mga file sa datos.Kini nga artikulo naghatag sa orihinal nga datos.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Pag-ila sa kasilinganan: gamit ang biotinylation nga nagsalig sa duol aron mailhan ang mga complex sa protina ug mga organel sa mapa. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Pag-ila sa kasilinganan: gamit ang biotinylation nga nagsalig sa duol aron mailhan ang mga complex sa protina ug mga organel sa mapa.Gingras, AS, Abe, KT ug Raut, B. Pagkapamilyar sa palibot: gamit ang biotinylation nga nagsalig sa duol aron mailhan ang mga complex sa protina ug mga organel sa mapa. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Pagsabot sa kasilinganan: gamita ang pagsalig sa kasilinganan sa biolohikal nga kinabuhi.Gingras, AS, Abe, KT ug Raut, B. Pagsabot sa kaduol: paghulagway sa mga komplikadong protina ug pagmapa sa mga organel gamit ang biotinylation nga nagsalig sa duol.kasamtangan.Akong opinyon.Kemikal.biology 48, 44–54 (2019).
Geri, JB ug uban pa.Pagmapa sa microenvironment pinaagi sa pagbalhin sa enerhiya sa Dexter ngadto sa immune cells.Science 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL ug uban pa.Ang duha-ka-proteome nga sukdanan nga mga network nakamatikod sa cell-specific nga pagbag-o sa interaksyon sa tawo.Mga selula 184, 3022–3040.e3028 (2021).
Oras sa pag-post: Sep-15-2022
