Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta sa CSS.Alang sa labing kaayo nga kasinatian, among girekomenda nga mogamit ka usa ka bag-ong browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Sa kasamtangan, aron masiguro ang padayon nga suporta, among ihatag ang site nga walay mga estilo ug JavaScript.
Ang mga selula sa kanser nagbag-o sa lainlaing mga mekanismo aron mabuntog ang tensiyon sa cellular ug magpadayon sa pag-uswag.Ang protina kinase R (PKR) ug ang protein activator niini (PACT) mao ang mga inisyal nga tigtubag nga nagmonitor sa lainlaing mga signal sa stress nga nagdala sa pagpugong sa pagdaghan sa cell ug apoptosis.Bisan pa, ang regulasyon sa agianan sa PACT-PKR sa mga selula sa kanser nagpabilin nga wala mahibal-an.Dinhi, among nakit-an nga ang dugay nga non-coding RNA (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) direktang nalangkit sa pagpugong sa PACT-PKR nga agianan ug nagpasiugda sa pagdaghan sa selula sa kanser.Gamit ang dako-dako nga functional screening sa CRISPRi 971 cancer-associated lncRNA, among nakit-an nga ang DARS-AS1 nalangkit sa kamahinungdanon nga gipauswag ang pagdaghan sa selula sa kanser.Busa, ang DARS-AS1 knockout nagpugong sa pagdaghan sa selula ug nagpasiugda sa cancer cell apoptosis sa nagkalain-laing mga linya sa selula sa kanser sa vitro ug makapakunhod sa pagtubo sa tumor sa vivo.Sa mekanikal nga paagi, ang DARS-AS1 direkta nga nagbugkos sa domain sa pagpaaktibo sa PACT ug gipugngan ang interaksiyon sa PACT-PKR, sa ingon pagkunhod sa pagpaaktibo sa PKR, eIF2α phosphorylation, ug pagpugong sa pagkamatay sa apoptotic cell.Sa klinika, ang DARS-AS1 kaylap nga gipahayag sa daghang mga kanser, ug ang sobra nga pagpahayag niini nga lncRNA nagpaila sa usa ka dili maayo nga prognosis.Gipatin-aw sa kini nga pagtuon ang regulasyon nga piho sa kanser sa agianan sa PACT-PKR pinaagi sa DARS-AS1 lncRNA ug naghatag lain nga target alang sa prognosis ug pagtambal sa kanser.
Ang katakus sa pagpahiangay sa tensiyon usa ka hinungdanon nga kinaiya sa pagkaluwas ug pagdaghan sa selula sa kanser.Ang paspas nga pagdaghan ug metabolic nga mga timaan sa kanser nag-una sa grabe nga mga microenvironment-kakulang sa sustansya, hypoxia, ug ubos nga pH-nga mahimong mag-trigger sa cell death signaling pathways.Ang dysregulation sa stress-sensitive nga mga gene sama sa p535, heat shock proteins 6, 7, KRAS8, 9, ug HIF-110, 11, 12, 13 kanunay nga naobserbahan sa kanser, sa ingon nagbabag sa apoptosis ug nagpasiugda sa pagkaluwas.
Ang protina kinase R (PKR) usa ka importante nga stress sensor ug subunit kinase sa eukaryotic initiation factor 2α (eIF2α), usa ka translational regulator nga nagsumpay sa cellular stress ngadto sa cell death.Ang PKR orihinal nga giila nga usa ka antiviral nga protina pinaagi sa pagkakita sa usa ka langyaw nga double-stranded RNA (dsRNA).Sa pagpaaktibo, PKR phosphorylates eIF2α sa pagpugong sa viral ug cellular protina synthesis14,15,16.Ang PACT (PKR activator protein) giila nga una nga PKR activator protein kung wala ang dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Pinaagi sa direkta nga interaksyon sa PKR, ang PACT nagbalhin sa lainlaing mga kapit-os (serum gutom, peroxide o arsenite nga pagtambal) ngadto sa PKR ug downstream signaling pathways.Dugang sa eIF2α phosphorylation, ang PACT-mediated PKR activation nag-aghat sa nagkalain-laing mga panghitabo nga may kalabutan sa stress response, lakip na ang giusab nga redox status pinaagi sa PI3K / Akt24 nga agianan, gipalambo ang DNA damage checking pinaagi sa p5325,26 ug NF-κB27,28 Regulates transcription, 29. Gihatag ang ilang kritikal nga papel sa pagtubag sa tensiyon, pagdaghan, apoptosis ug uban pang hinungdanon nga proseso sa cellular, ang PKR ug PACT nagsaad nga mga target nga terapyutik alang sa daghang mga sakit, labi na ang cancer30,31,32,33.Bisan pa, bisan pa niini nga pleiotropic functional ug biological nga kahulogan, ang regulasyon sa PACT/PKR nga kalihokan sa mga selula sa kanser nagpabilin nga idlas.
Ang lncRNAs kay mga transcript nga mas dako pa sa 200 ka nucleotides nga walay potensyal sa pag-coding sa protina.Tungod kay ang mga cutting-edge nga tibuok genome sequencing nga mga proyekto nakaila sa liboan ka mga lncRNAs, 35,36 dako nga paningkamot ang gihimo aron sa pagpatin-aw sa ilang biological nga mga gimbuhaton.Ang nagkadako nga pundok sa panukiduki nagpakita nga ang lncRNAs nalambigit sa daghang biolohikal nga mga proseso37 apil ang regulasyon sa X-chromosome inactivation38,39, imprinting40, transcription41,42, translation43 ug bisan cancer growth44,45,46,47.Gi-report sa kini nga mga pagtuon nga daghang mga lncRNA ang nahilambigit sa agianan sa PACT/PKR.Usa sa maong pagtuon nagpakita nga ang lncRNA ASPACT nagpugong sa PACT transcription ug nagdugang sa nukleyar nga retensyon sa PACT mRNA.Gipakita sa ubang mga pagtuon nga ang lncRNA nc886 nagbugkos sa PKR ug nagpugong sa phosphorylation niini49,50.Sa pagkakaron, ang lncRNA nga nag-regulate sa PACT-mediated PKR activation wala pa gitaho.
Ang Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) giila nga usa ka oncogenic lncRNA51,52,53,54.Pinaagi sa regulasyon sa miP-194-5p53, miP-12952 ug miP-532-3p51, ang DARS-AS1 gipakita nga nagpasiugda sa pagtubo sa tin-aw nga cell renal cell carcinoma, thyroid carcinoma ug non-small cell lung carcinoma, matag usa.Nakaplagan usab ni Tong ug mga kauban nga ang DARS-AS1 nagpasiugda sa pag-uswag sa myeloma pinaagi sa pagpadayon sa kalig-on sa protina nga 39 (RBM39) RNA-binding motif.Bisan pa, wala’y mga pagtuon nga gihimo kung kini nga lncRNA nahilambigit sa regulasyon sa pagpaaktibo sa PACT-PKR ug ang tubag sa stress sa mga selula sa kanser.
Dinhi, naghimo kami usa ka dako nga screen sa pagkawala sa function gamit ang CRISPRi system ug gitino nga ang DARS-AS1 lncRNA nagpasiugda sa pagdaghan sa daghang mga lahi sa mga selula sa kanser.Dugang pa, nahibal-an namon ang usa ka mayor nga mekanismo: ang DARS-AS1 direktang nagbugkos sa PACT, nagpugong sa PACT ug PKR nga nagbugkos, nagpugong sa phosphorylation sa eIF2α, usa ka ubos nga substrate sa PKR, ug sa katapusan nagpugong sa apoptotic cell death.Sa konklusyon, gipadayag sa among trabaho ang DARS-AS1 lncRNA ingon usa ka regulator sa agianan sa PACT-PKR ug usa ka potensyal nga target alang sa pagtambal ug prognosis sa kanser.
Ang daghang mga pagtuon sa genomic profiling nakaila sa gatusan ka mga lncRNA nga adunay kalabotan sa kanser.Bisan pa, ang ilang gimbuhaton nagpabilin nga wala mahibal-an56.Aron mahibal-an ang nagsaad nga mga kandidato sa lncRNA nga nalambigit sa pag-uswag sa kanser, naghimo kami usa ka screen sa pagkawala sa function alang sa pagkunhod sa pagdaghan sa linya sa selula sa SW620 colorectal cancer gamit ang CRISPRi system (Fig. 1a).Ang talagsaon nga bahin sa SW480 ug SW620 nga mga linya sa selula sa kanser sa colon kay kini gikan sa panguna ug sekondaryang mga tumor sa usa ka pasyente.Naghatag kini usa ka hinungdanon nga pagtandi alang sa pagtuon sa mga pagbag-o sa genetic sa pag-uswag sa advanced cancer sa colon.Busa, among gisusi ang mga transcriptomes sa colorectal cancer cell lines (SW480 ug SW620) gamit ang RNA sequencing ug gikolekta ang pipila ka potensyal nga functional lncRNAs gikan sa gipatik nga literatura.Pinasukad sa kini nga mga resulta, nagdisenyo kami usa ka pooled sgRNA library nga adunay sulud nga 7355 sgRNA oligos nga gipunting ang 971 nga mga lncRNA nga may kalabotan sa kanser ug 500 nga wala gipunting nga sgRNA oligos alang sa negatibo nga kontrol (Supplementary Data 1).
Ang eskematiko nga representasyon sa screening gamit ang CRISPRi system.b sgRNA enrichment human sa screening.Ang pinahigda nga tuldok nga linya nagrepresentar sa log2 (pagbag-o sa pilo) = ± 0.58.Ang bertikal nga tuldok nga linya nagpaila sa p value = 0.05.Ang mga itom nga tulbok nagrepresentar sa dili target nga sgRNA (gitudlo nga NC).Ang mga pula nga tulbok mao ang mga sgRNA nga nagpunting sa DARS-AS1.Ang mga asul nga tulbok mao ang mga sgRNA nga nagpunting sa LINC00205, usa ka kaniadto nga gihulagway nga oncogenic lncRNA.fold change = (normalized nga pagbasa, adlaw 17)/(normalized nga pagbasa, adlaw 0).c DARS-AS1 sgRNA knockdown nagpugong sa pagtubo sa selula.Ang mga error bar nagrepresentar sa ± standard deviation sa tulo ka mga eksperimento.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 duha ka ikog nga t-test sa Estudyante.d DARS-AS1 nga ekspresyon sa mga tumor (TCGA dataset).em Expression sa DARS-AS1 sa gipares nga normal ug tumor samples gikan sa mga pasyente nga adunay BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, ug COAD, matag usa (TCGA dataset).Ang mga p-value nakuha gamit ang gipares nga two-tailed Student's t-test.
Pagkahuman sa pagtukod sa plasmid ug pagputos sa lentivirus, among gibalhin ang dCas9-SW620 colorectal cancer cell line nga adunay librarya sa ibabaw sa upat ka independenteng mga eksperimento sa impeksyon.Ang multiplicity of infection (MOI) alang niini nga mga impeksyon mao ang 0.1-0.3, nga nagpakita nga ang matag cell mahimo lamang mabalhin sa usa ka sgRNA.Human sa 18 ka adlaw sa in vitro culture, ang enrichment profile sa target sgRNAs mikunhod o mitaas human sa screening, samtang ang gidaghanon sa non-targeted control oligonucleotides nagpabilin nga medyo wala mausab kumpara sa pre-screening profile, nga nagpakita nga ang atong target adunay taas nga screen-specific. librarya.bugas.1b ug supplementary table 1). Ang LINC00205, nga kaniadto gitaho nga nagpasiugda sa kanser sa baga ug pag-uswag sa kanser sa atay58,59,60, gi-screen out (log2 (foldchange) <−0.58, p value <0.05), nga nagpamatuod sa pagkakasaligan niini nga screening (Fig. 1b). Ang LINC00205, nga kaniadto gitaho nga nagpasiugda sa kanser sa baga ug pag-uswag sa kanser sa atay58,59,60, gi-screen out (log2 (foldchange) <−0.58, p value <0.05), nga nagpamatuod sa pagkakasaligan niini nga screening (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). Ang LINC00205, nga kaniadto gitaho nga nagpasiugda sa pag-uswag sa kanser sa baga ug kanser sa atay58,59,60, wala iapil (log2 (pagbag-o sa pilo) <-0.58, p-value <0.05), nga nagpamatuod sa kalig-on niini nga screening (Fig. 1b) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). Ang LINC00205, nga kaniadto gitaho nga nagpasiugda sa pag-uswag sa kanser sa baga ug atay58,59,60, wala iapil (log2 (pagbag-o sa pilo) <-0.58, p-value <0.05), nga nagpamatuod sa kalig-on niini nga screening (Fig. 1b).
Taliwala sa tanan nga lncRNAs nga gisulayan, DARS-AS1 usab screened, uban sa tulo ka cognate sgRNA oligonucleotides kamahinungdanon pagkunhod human sa 18 ka adlaw sa kultura, nga nagsugyot nga knockdown niini nga lncRNA miresulta sa pagkunhod sa kanser proliferation (Fig. 1b).Kini nga resulta dugang nga gisuportahan sa MTS analysis sa colorectal cancer cells nga nagpakita nga ang growth rate sa DARS-AS1 knockdown nga mga selyula gitunga lang kumpara sa control cells (Figure 1c) ug nahiuyon sa nangaging mga taho sa ubang mga matang sa kanser.: clear cell kidney cancer, thyroid cancer ug non-small cell lung cancer51,52,53,55.Bisan pa, ang function niini ug ang mga mekanismo sa molekula sa colorectal cancer nagpabilin nga wala masusi.Busa, gipili namo kini nga lncRNA alang sa dugang nga pagtuon.
Aron matun-an ang ekspresyon sa DARS-AS1 sa mga pasyente, komprehensibo namon nga gisusi ang 10,327 nga mga sample sa tumor gikan sa proyekto sa Cancer Genome Atlas (TCGA).Gipakita sa among mga resulta nga ang DARS-AS1 kaylap nga gipahayag ug labi nga na-upregulate sa himsog nga mga selyula sa lainlaing mga tumor, lakip ang colon adenocarcinoma (COAD), renal clear cell carcinoma (KIRC), ug renal papillary cell carcinoma (KIRP)..Gamay ra (Fig. 1d ug Supplementary Fig. 1a, b). Ang pag-analisar sa gipares nga himsog / tumor nga mga sample dugang nga nagpamatuod sa usa ka mas taas nga ekspresyon sa DARS-AS1 sa mga tumor sa pantog urothelial carcinoma (BLCA), kidney renal clear cell carcinoma (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), lung squamous cell carcinoma (LUSC) , uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC), lung adenocarcinoma (LUAD), liver hepatocellular carcinoma (LIHC), kidney renal papillary cell carcinoma (KIRP), ug colon adenocarcinoma (COAD) (p value <0.05) (Fig. 1e-m) . Ang pag-analisar sa gipares nga himsog / tumor nga mga sample dugang nga nagpamatuod sa usa ka mas taas nga ekspresyon sa DARS-AS1 sa mga tumor sa pantog urothelial carcinoma (BLCA), kidney renal clear cell carcinoma (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), lung squamous cell carcinoma (LUSC) , uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC), lung adenocarcinoma (LUAD), liver hepatocellular carcinoma (LIHC), kidney renal papillary cell carcinoma (KIRP), ug colon adenocarcinoma (COAD) (p value <0.05) (Fig. 1e-m) .Ang pag-analisar sa gipares nga himsog / tumor nga mga sample usab nagpamatuod nga mas taas nga ekspresyon sa DARS-AS1 sa pantog nga urothelial carcinoma (BLCA), tin-aw nga cell renal ug renal cell carcinoma (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), lung squamous cell carcinoma (LUSC) nga mga tumor., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m). , endometrial carcinoma sa corpus uteri (UCEC), adenocarcinoma sa baga (LUAD), hepatocellular carcinoma sa atay (LIHC), papillary cell carcinoma sa kidney (KIRP), ug adenocarcinoma sa colon (COAD) (p value < 0.05) (Fig. 1e– m) .配对 健康 / 肿瘤样本 的 分析 进一步 证实证实 Dars-as1 在 膀胱 尿路 尿路 膀胱 肾 透明 透明 透明 透明 透明 细胞癌 细胞癌 细胞癌 (Prad), 肺鳞状 细胞癌 的 的显着 更 高 表达, 子宫体子宫 内膜 癌 (UCEC), 肺腺癌 (Luad), 肝肝 细胞癌 肾 肾 乳头状 细胞癌 细胞癌 (Kirp) (P 值<0.05）（图1e-m） .. (LULC)癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .Ang pag-analisar sa himsog / tumor nga gipares nga mga sample dugang nga nagsuporta sa papel sa DARS-AS1 sa pantog nga urothelial carcinoma (BLCA), tin-aw nga cell renal cell carcinoma (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), ug lung squamous cell carcinoma (LUSC) nga mga tumor.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). ekspresyon sa corpus uterine carcinoma (UCEC), lung adenocarcinoma (LUAD), hepatocellular carcinoma (LIHC), renal papillary cell carcinoma (KIRP), ug colon adenocarcinoma (COAD) (p value <0.05) (Figure 1e -m).Gihiusa, kini nga mga resulta nagpakita nga ang DARS-AS1 kaylap ug gipahayag pag-ayo sa lainlaing mga kanser.
Tungod kay ang DARS-AS1 ug DARS (ang gene nga nag-encode sa antisense strand) nag-ambit sa parehas nga tigpasiugda ug nahimutang sunod sa usag usa, among gidesinyo ang shRNA aron espesipikong matumba ang DARS-AS1 apan dili DARS (Supplementary Fig. 2a, b ug Supplementary Table 2) .Dugang sa SW620, gigamit usab namo ang tulo ka laing mga linya sa cell nga nagpahayag sa DARS-AS1 aron tun-an ang pagka-epektibo ug pag-obra sa shRNA knockdown (Supplementary Table 3).Gipakita sa among mga resulta nga ang tanan nga tulo nga mga shRNA nga naugmad nakab-ot labing menos 80% DARS-AS1 knockdown nga kahusayan nga adunay gamay nga epekto sa kantidad sa DARS mRNA (Supplementary Fig. 2c-f).Dugang pa, nahibal-an namon nga ang pag-knockdown sa DARS-AS1 sa kini nga mga shRNA hinungdanon nga nakapugong sa pagtubo sa cell sa mga linya sa selula sa kanser sa colorectal nga SW620 (49.7%) ug HCT116 (27.7%), linya sa selula sa kanser sa suso MBA-MD-231 (53.4%).) ug ang HepG2 hepatoma cell line (92.7% reduction), ingon man ang ilang abilidad sa pagporma sa unachored spheres (average nga pagkunhod sa ~ 50.8%, 44.6%, 40.7% ug 75.7% kada cell line) (Fig. 2a,b).Sa SW620, ang mga resulta sa colony formation assay dugang nga nagpamatuod nga ang DARS-AS1 shRNA mahinungdanon nga nagpugong sa pagdaghan sa selula nga adunay average nga pagkunhod sa gibana-bana nga 69.6% (Fig. 2c).
Epekto sa control shRNA ug DARS-AS1 shRNA sa cell proliferation (a) ug spheroid formation (b) sa SW620, HCT116, MBA-MD-231, ug HepG2 cells.c Epekto sa control shRNA ug DARS-AS1 shRNA sa colony formation sa SW620 cells.Ang pagdaghan sa selula (d), pagporma sa spheroid (e), ug pagporma sa kolonya (f) sa mga selula sa SW620 nga nag-overexpress sa DARS-AS1.Ang datos nga gipakita mao ang mean ± standard deviation sa tulo ka eksperimento.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, ug *** p ≤ 0.001 pinaagi sa two-tailed Student's t-test.
Aron makompleto ang mga pagtuon sa pagkawala sa function, sunod namong gimugna ang SW620 nga mga selula nga nag-overexpress sa DARS-AS1 (Supplementary Fig. 2g).Ang sobrang pag-ekspresyon sa DARS-AS1 dako kaayog nadugangan ang pagtubo sa selula (1.8-pilo), unachored spheroid formation (1.4-fold), ug colony formation (3.3-fold) sa SW620 cells (Fig. 2d-f).Gikumpirma namo kini nga resulta gamit ang laing DARS-AS1 nga nagpahayag sa cell line, A549.Kini nga gipauswag nga pagdaghan sa cell tungod sa sobrang pagpahayag sa DARS-AS1 dugang nga naobserbahan sa mga selula sa A549 (Supplementary Fig. 2h, i ug Supplementary Table 3).Gihiusa, kini nga mga pagtuon sa ganansya ug pagkawala nagpakita nga ang DARS-AS1 nagpasiugda sa pagdaghan sa selula sa kanser sa vitro.
Aron masusi ang nagpahiping mekanismo diin ang DARS-AS1 nag-regulate sa pagdaghan sa cell, naghimo kami usa ka pag-analisa sa pull-down sa RNA aron mahibal-an ang potensyal nga mga kauban nga nagbugkos sa protina.Ang mga resulta sa RT-qPCR nagpakita nga mga 86.2% sa DARS-AS1 nahimutang sa cytoplasm sa SW620 cells (Supplementary Fig. 3a).Ang in vitro nga gi-transcribe nga biotinylated DARS-AS1 o pseudoRNA dayon gilumlom sa SW620 cell lysates nga gisundan sa SDS-PAGE separation.Ang sunod nga pilak nga pagmantsa nagpakita nga ang usa ka lahi nga banda (~ 38 kDa) labi nga gipadato sa mga sample sa DARS-AS1 nga pull apan dili sa dummy RNA o mga sampol sa beads (Fig. 3a).Kini nga banda giila nga usa ka PKR activating protein (PACT) pinaagi sa mass spectrometry (MS) ug dugang nga gikumpirma pinaagi sa immunoblotting sa SW620, HCT116, ug HepG2 cell lines (Fig. 3a,b).Ang pagpauswag sa DARS ug may kalabutan nga mga protina sa PACT - PKR ug TRBP - gisusi usab gamit ang pagtuki sa RNA pinaagi sa Western blotting (WB).Ang mga resulta nagpakita nga walay direktang interaksyon tali sa DARS-AS1 RNA ug kining tulo ka mga protina nakit-an (Supplementary Fig. 3b).Ang espesipikong interaksyon tali sa DARS-AS1 ug PACT dugang nga gipamatud-an sa RNA immunoprecipitation (RIP) nga pag-analisa, nga nagpakita nga ang DARS-AS1 mahinungdanon nga gipadato sa anti-PACT nga mga antibodies apan dili sa ubang mga kontrol nga RNAs (Figure 3c).Aron mahibal-an kung ang DARS-AS1 direktang nakig-uban sa PACT kung wala ang bisan unsang ubang mga sangkap sa cellular, usa ka in vitro biolayer interferometry (BLI) assay ang gihimo gamit ang purified PACT.Ang biotin-label nga DARS-AS1 o dummy RNA wala mapalihok sa streptavidin (SA) biosensors ug dayon gilumlom sa kinetic buffer nga adunay 1 μM PACT.Ilabi na, ang PACT hugot nga gigapos sa DARS-AS1 (KD nga kantidad ~ 26.9 nM), apan dili sa pagsundog sa RNA (Figure 3d).Gikuha, kini nga mga resulta nagpakita sa usa ka direkta nga interaksyon ug taas nga kalambigitan tali sa DARS-AS1 ug PACT.
Ang RNA pull analysis nagpaila sa DARS-AS1 nga nakig-uban sa PACT sa SW620 cells.Sa ibabaw, pilak nga pagmantsa sa may kalabutan nga mga protina.Ang mga ubos nga immunoblots gihimo nga adunay anti-PACT antibody.b RNA pull-down analysis gihimo sa HCT116 (ibabaw) ug HepG2 (ubos) nga mga selula.Ang pagpauswag sa PACT nakit-an pinaagi sa immunoblotting.Ang cRNA immunoprecipitation (RIP) assays gihimo sa SW620 cells gamit ang gipakita nga mga antibodies.d PACT binding curves sa full-length DARS-AS1 o control RNA nakuha gamit ang biolayer interferometry (BLI).Ang RNA na-immobilized sa usa ka streptavidin biosensor.Ang 1 μM PACT gigamit sa pagsukod sa asosasyon.e RNA pull assay gihimo gamit ang biotinylated full-length DARS-AS1 o truncated (ibabaw).Immunoblot nga nagpakita sa PACT nga nadawat (ubos).f Ang purified flagged PACT gilusok sa biotinylated full-length DARS-AS1 o giputol (sama sa e) para sa in vitro RIP assay.Ang nakuha nga RNA gipamatud-an sa RT-qPCR.g Ang relative affinity sa lain-laing RNA fragment para sa PACT nakuha gamit ang biolayer interferometry.Alang sa pagtuki, gigamit ang 100 nM RNA ug 1 μM RAST.h In vitro RIP assays gihimo gamit ang purified intact o truncated labeled PACT.Ang nakuha nga RNA gipamatud-an sa RT-qPCR.i Ang rate sa pagtubo sa SW620 nga mga selula nga nag-overexpress sa DARS-AS1, PACT, o pareho.j Ang sobrang pagpahayag sa bug-os nga gitas-on o naputol nga DARS-AS1 sa SW620 nga mga selula adunay lainlaing epekto sa pagtubo sa selula.Ang k Apoptosis nakit-an pinaagi sa immunoblotting nga adunay anti-PARP antibody.l Knockout sa DARS-AS1 nag-aghat sa apoptosis sa SW620 nga mga selula sama sa gipakita sa flow cytometry.Ang datos nga gipakita mao ang mean ± standard deviation sa tulo ka eksperimento. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, pinaagi sa two-tailed Student's t test. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, pinaagi sa two-tailed Student's t test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001 pinaagi sa two-tailed Student's t-test. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001 pinaagi sa two-tailed Student's t-test.
Naghimo kami og tulo ka biotinylated DARS-AS1 RNA fragment pinaagi sa in vitro transcription aron mahibal-an ang DARS-AS1 nga rehiyon nga gikinahanglan alang sa PACT association (Figure 3e).Ang mga resulta sa pag-analisa sa RNA nagpakita nga ang matag tipik makahimo sa pagpakig-uban sa PACT, apan ang 3′-terminal nga rehiyon (384-768 nucleotides nga gimarkahan nga A3) nagpakita nga labaw pa sa 1-384 nga mga nucleotides nga gimarkahan nga A1) (Fig. 3e).Ang susamang mga resulta naobserbahan sa in vitro RIP assay gamit ang recombinant PACT (Figure 3f).Nahiuyon niini nga mga resulta, ang mga eksperimento sa pagbugkos sa immobilized RNA fragments ngadto sa PACT gamit ang BLI nagpakita usab nga ang PACT adunay mas taas nga affinity alang sa A3 (384-768 nt) (KD nga kantidad nga gibana-bana nga 94.6 nM), samtang halos walay mga link sa ubang mga lugar.(Fig. 3d).
Gisusi usab namo ang mga kaubang nagbugkos nga mga rehiyon sa PACT.Ang PACT adunay tulo ka functional domains, ang duha niini gikonserbar nga double-stranded RNA-binding domains (dsRBD) ug ang ikatulo nga domain (gitudlo nga D3) nga naglihok isip activator sa mga interaksyon sa protina.Aron masusi ang kapasidad sa pagbugkos sa lncRNA sa matag domain, gi-engineer namon ang tulo nga mutation nga nagtangtang sa matag usa sa tulo nga mga domain ug nagpahigayon usa ka in vitro RIP assay.Gipakita sa among mga resulta nga ang pagtangtang sa ikatulo nga domain (D3) sa PACT makahuluganon nga nakunhuran ang interaksyon niini sa DARS-AS1 (sa 0.11-pilo kumpara sa intact PACT) kumpara sa ubang duha nga mutation (Fig. 3h), gipakita nga ang pagpagawas sa D3 nakig-uban sa DARS.-AC1.Gikuha, kini nga mga resulta nagsugyot nga ang interaksyon tali sa DARS-AS1 ug PACT mahimong mahitabo una pinaagi sa 3 ′ nga katapusan sa DARS-AS1 ug ang D3 domain sa PACT.
Among namatikdan nga ang DARS-AS1 walay epekto sa PACT nga ekspresyon ug ang PACT walay epekto sa DARS-AS1 (Supplementary Fig. 3c).Dayon among gisusi ang epekto sa PACT knockdown sa pagtubo sa selula.Sukwahi sa DARS-AS1, ang mga paryente nga selula mitubo sa 1.5-3 ka beses nga mas paspas sa dihang ang PACT natumba (Supplementary Fig. 3d).Ang mga resulta sa colony formation assay nagpakita nga ang mga selula nag-umol sa 2-3-fold nga mga kolonya human sa shRNA nga pagtambal sa PACT (Supplementary Fig. 3e).Aron masulayan kung gikontrol ba sa DARS-AS1 ang pagdaghan sa cell pinaagi sa PACT, nakamugna kami mga SW620 nga mga selula nga nag-overexpress sa PACT, DARS-AS1, o pareho.Ang sobrang pagpahayag sa PACT nagpakita sa mahinungdanon nga pagdili sa pagdaghan sa selula (Figure 3i).Samtang ang overexpression sa DARS-AS1 matag usa hinungdanon nga nagpasiugda sa pagdaghan sa cell, wala’y hinungdan nga kalainan sa rate sa pagtubo sa mga selyula nga nag-overexpress sa DARS-AS1 ug PACT.Kini nga mga resulta nagsugyot nga ang PACT mahimong makapugong sa dugang nga pagdaghan tungod sa DARS-AS1 nga sobra nga pagpahayag.
Tungod kay ang lainlaing mga rehiyon sa DARS-AS1 adunay lainlaing mga abilidad nga nagbugkos sa PACT, among gisusi ang ilang paryente nga impluwensya sa pagdaghan sa cell pinaagi sa lainlaing sobrang pagpahayag sa mga tipik sa DARS-AS1.Kung itandi sa laing duha ka mga tipik, ang DARS-AS1 sobra nga gipahayag sa 3 ′ nga katapusan (384-768 nt), ang nag-unang rehiyon nga may kalabutan sa PACT sa DARS-AS1, nga adunay pinakataas nga abilidad sa pagpukaw sa pagdaghan sa selula (Fig. 3j).Kini nga mga resulta nagpakita sa usa ka positibo nga correlation tali sa pagbugkos kapasidad ug biological function sa DARS-AS1.
Ang PACT gikataho nga usa ka pro-apoptotic protein19.Busa, among gisusi ang epekto sa DARS-AS1 sa apoptosis.Sama sa gipaabot, ang DARS-AS1 knockdown mahinungdanon nga nagdugang sa PARP cleavage sa SW620 nga mga selula ug nagdugang sa proporsyon sa annexin V-positive nga mga selula sa SW620, HCT116, HepG2, ug MBA-MD-231 nga mga linya sa selula (Fig. 3k).3).3f-h), nga nagpakita nga ang anti-apoptotic nga epekto sa DARS-AS1 sa mga selula sa kanser sukwahi sa apoptosis-inducing function sa PACT.Gikuha, kini nga mga resulta nagsugyot nga ang mekanismo sa DARS-AS1 oncogenic function mahimong pinaagi sa pagdili sa PACT function.
Sunod, among gisuhid ang functional nga mga implikasyon sa DARS-AS1-PACT nga asosasyon.Ang PACT gikataho nga ma-aktibo ang PKR pinaagi sa direkta nga interaksyon, nga pagkahuman nagpauswag sa eIF2α phosphorylation, hinungdan sa pagtangtang sa paghubad ug apoptosis17.Una, among gisusi kung ang DARS-AS1 nakaapekto sa cellular localization sa PACT ug PKR.Ang confocal fluorescence microscopy nagpakita nga ang PACT ug PKR kay na-colocalize sa SW620 cells nga adunay average nga Pearson correlation coefficient nga 0.72.Sa laing bahin, ang DARS-AS1 nga overexpression dako nga pagkunhod sa PACT ug PKR co-localization (nagpasabot nga Pearson correlation coefficient 0.61) (Figure 4a).Aron masusi kung ang DARS-AS1 mahimo nga modulate ang interaksiyon sa PACT-PKR, naghimo kami usa ka co-immunoprecipitation (co-IP) assay nga adunay anti-PACT antibody sa SW620 cell lysates.Ang PKR gipadato pag-ayo sa anti-PACT sa mga control cell, samtang ang pagbawi sa PKR mikunhod pag-ayo sa mga lysate gikan sa mga selula nga nag-overexpress sa DARS-AS1 (Fig. 4b).Ang giputli nga gimarkahan nga PACT ug PKR gigamit alang sa in vitro protein binding assays.Tungod niini, kadtong naghatag DARS-AS1 apan walay kontrol nga RNA nagpakita sa gipugngan nga interaksiyon sa PACT-PKR (Figure 4c).Ang tanang resulta nagpakita nga ang DARS-AS1 nakabalda sa komunikasyon sa PACT ug PKR.
Ang usa ka Co-localization sa PACT ug PKR sa mga control cell o mga cell nga nag-overexpress sa DARS-AS1 naobserbahan gamit ang confocal fluorescence microscopy.Ang nuclei nabulit sa DAPI.Ang mga resulta sa estadistika nakuha gikan sa 16 ka mga litrato.b Co-immunoprecipitation (co-IP) gamit ang anti-PACT antibody sa cell lysates sa pagkontrol sa SW620 nga mga selula o mga selula nga nag-overexpress sa DARS-AS1.c Gimarkahan nga PACT, giputli nga PKR ug gi-transcribe sa vitro nga adunay DARS-AS1 o mock RNA nga gilumlum alang sa in vitro protein binding analysis.Ang mga anti-flag antibodies gigamit alang sa immunoprecipitation.Ang mga immunoblots nga adunay gipakita nga mga antibodies gihimo sa SW620 ug HCT116 nga mga selula nga gibalhin nga adunay kontrol nga shRNA o DARS-AS1-shRNA nga gisundan sa serum nga kagutom.Ang lebel sa ekspresyon sa DARS-AS1 nagbag-o sa pagkasensitibo sa cellular sa thapsigargin.Ang mga selula sa SW620 gibalhin sa DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 overexpression plasmid o control plasmid.Ang mga selula gitambalan sa thapsigargin sulod sa 48 ka oras ug ang cell viability gitino gamit ang MTS reagent.f In vitro transcribe DARS-AS1 o dummy RNA ug purified PACT gigamit alang sa in vitro activation assay ug immunoblot detection.g Ang mga immunoblots nga naggamit niini nga mga antibodies gihimo sa SW620-ctrl nga mga selula (wala) o mga selula nga nag-overexpress sa PKR mutant (tuo).Kini nga mga selyula dayon gibalhin sa control shRNA o DARS-AS1-shRNA nga gisundan sa serum nga kagutom.h Flow cytometry nagpakita nga ang inactivation sa mutant PKR bayad alang sa DARS-AS1-induced apoptosis sa SW620 cells.i Ang mga immunoblot nga adunay gipakita nga mga antibodies gihimo sa SW620 (wala) o HCT116 (tuo) nga mga selyula.Ang mga selula nga gibalhin nga adunay kontrol nga shRNA o DARS-AS1 shRNA gihikawan sa serum ug gidugangan sa 100 nM PKR C16 inhibitor o DMSO.Scale bar = 5 µm.Ang datos nga gipakita mao ang mean ± standard deviation sa tulo ka eksperimento.* p ≤ 0.05 duha ka ikog nga t-test sa Estudyante.
Gituohan sa kadaghanan nga sa higayon nga makig-uban ang PACT sa PKR17, ang phosphorylation sa PKR sa Thr451 mahimong maaghat.Gipakita sa among mga resulta nga ang lebel sa phosphorylation sa PKR labi nga gipataas sa DARS-AS1 nga knockdown nga mga selula pagkahuman sa serum nga kagutom (Fig. 4d ug Supplementary Fig. 4a).Tungod niini, among nakit-an nga ang phosphorylation sa eIF2α, ang nag-unang substrate sa PKR, gipadako usab sa DARS-AS1 shRNA (Fig. 4d ug Supplementary Fig. 4a).Ang Thapsigargin usa ka stressor sa ER nga maoy hinungdan sa pagpagawas sa ER sa Ca2+.Ang pagtambal sa thapsigargin gikataho nga makapukaw sa ekspresyon ug pagpaaktibo sa PACT, nga dugang nga nakig-uban ug nagpalihok sa PKR, nga nagdala ngadto sa apoptosis pinaagi sa pagdugang sa eIF2α phosphorylation 18,61.Dinhi, gigamit namon ang thapsigargin ingon usa ka stimulator sa agianan sa PACT / PKR aron masusi kung ang DARS-AS1 makatabang sa mga selyula nga mabuntog ang stress pinaagi sa pagpugong sa agianan sa PACT / PKR.Naobserbahan namon nga ang lebel sa DARS-AS1 nga ekspresyon positibo nga may kalabotan sa pagsukol sa cell sa thapsigargin.Ang mga selula sa SW620 nga nag-overexpress sa DARS-AS1 nakalahutay nga mas maayo kung gitambalan sa thapsigargin, samtang ang mga selula nga adunay DARS-AS1 knockdown nahimong mas daling madala (Fig. 4e).Nahiuyon sa kini nga mga sangputanan, ang sobra nga pagpahayag sa DARS-AS1 nakunhuran ang thapsigargin-induced PKR phosphorylation (Supplementary Fig. 4b).Sa kasukwahi, human sa pagtambal sa thapsigargin, ang PKR ug eIF2α gi-phosphorylated sa mas taas nga gidak-on sa DARS-AS1 knockdown cells kumpara sa control cells (Supplementary Fig. 4b).Makapainteres, ang thapsigargin nag-aghat sa DARS-AS1 nga ekspresyon sa usa ka paagi nga nagsalig sa dosis, nga mahimong magpakita sa usa ka anti-stress function sa DARS-AS1 (Supplementary Fig. 4c).Dugang pa, naghimo kami og in vitro activation assays aron kumpirmahon kini nga mga obserbasyon.Sa laktud, ang PKR giputli gikan sa cell lysates gamit ang anti-PKR antibody, dayon gilumlom sa recombinant PACT ug DARS-AS1 nga gi-transcribe sa vitro.Pagkahuman sa reaksyon sa enzymatic, ang phospho-PKR nakit-an gamit ang WB.Gipakita sa among mga resulta nga ang PKR phosphorylation hinungdanon nga gipugngan sa DARS-AS1, apan dili pinaagi sa pagkontrol sa RNA (Figure 4f).Kini nga mga resulta sa vitro ug in vivo nagsugyot nga ang DARS-AS1 nagpugong sa pagpaaktibo sa PKR nga gipataliwala sa PACT.Sa parehas nga oras, nakita usab namon ang pagkunhod sa pagbawi sa PACT sa presensya sa DARS-AS1 (Figure 4f).Kini nga resulta nahiuyon sa mga resulta sa in vitro protein binding assay (Figure 4c) ug pag-usab naghulagway sa blocking function sa DARS-AS1 alang sa PACT-PKR association.
Ang Ser246 ug Ser287 sa D3 domain sa PACT gikinahanglan alang sa PKR activation ubos sa cellular stress.Ang pag-ilis sa duha ka serine residues alang sa alanine naghatag og mutant PACT (mutD), nga nagpa-aktibo sa PKR kung walay stress, ug ang pag-ilis sa alanine (mutA) mibali sa protocol.Tungod kay among gipakita ang kahinungdanon niini nga domain sa direktang pagpakig-uban sa DARS-AS1, among gimugna kining duha ka PACT mutant aron sulayan kung kini nga mga residues mahimo usab nga maapil sa interaksyon sa DARS-AS1.Makapainteres, ang duha ka mutant nawad-an sa abilidad sa paggapos sa DARS-AS1 (Supplementary Fig. 4d), nga nagsugyot nga ang kompleto nga istruktura sa PACT nga protina mahimong gikinahanglan alang sa episyente nga pakig-uban sa DARS-AS1.
Dugang pa, ang among mga resulta nagsugyot usab nga ang DARS-AS1-shRNA-induced inhibition sa cell proliferation mahimong partially ibalik pinaagi sa overexpressing sa usa ka dominanteng negatibo nga PACT mutant (PACTmutA) o usa ka dominanteng negatibo nga PKR mutant (PKRmut) (Supplementary Fig. 4e. e).Ang sobrang pagpahayag sa dominant-negatibong PKR mutants nakunhuran ang PKR phosphorylation nga gipahinabo sa DARS-AS1 knockdown ingon man ang eIF2α phosphorylation sa serum-deprived cells (Fig. 4g).Labaw sa tanan, ang proporsyon sa mga apoptotic nga mga selula nga gipahinabo sa DARS-AS1 nga knockdown gipakunhod usab sa mga selula nga nag-overexpress sa PKRmut (Fig. 4h ug Supplementary Fig. 4g).Ang pagpugong sa kalihokan sa PKR kinase makadaut usab sa DARS-AS1 nga function, tungod kay ang mga resulta nagpakita nga ang DARS-AS1 knockdown panagsa ra nga hinungdan sa PKR ug eIF2α phosphorylation kung ang mga selula gitambalan sa usa ka PKR-specific C16 inhibitor (Fig. 4i ug Supplementary Fig. 4h).).Gihiusa, ang among mga resulta nagsugyot nga ang DARS-AS1 nagpasiugda sa pagdaghan sa cell, labing menos sa bahin, pinaagi sa pagpugong sa pagpaaktibo sa PKR nga gipataliwala sa PACT.
Aron masusi pa ang papel sa DARS-AS1 sa tumorigenesis, gihimo namon ang mga eksperimento sa vivo gamit ang usa ka modelo sa xenograft sa mouse. Ang mga resulta nagpakita nga ang knockdown sa DARS-AS1 mahinuklugong mikunhod sa pagtubo sa tumor sa mga ilaga (p value <0.0001) (Fig. 5a). Ang mga resulta nagpakita nga ang knockdown sa DARS-AS1 mahinuklugong mikunhod sa pagtubo sa tumor sa mga ilaga (p value <0.0001) (Fig. 5a). Результати показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). Gipakita sa mga resulta nga ang DARS-AS1 knockdown kusog nga nagpamenos sa pagtubo sa tumor sa mga ilaga (p value <0.0001) (Figure 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 Результати показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис. 5а). Ang mga resulta nagpakita nga ang DARS-AS1 knockdown nga kamahinungdanon nakunhuran ang pagtubo sa tumor sa mga ilaga (p value <0.0001) (Figure 5a).Busa, sa DARS-AS1 knockdown nga grupo, adunay usa ka mahinungdanon nga pagkunhod sa mean tumor volume sa mahitungod sa 72.9% ug nagpasabot sa tumor mass sa mga 87.8% (Figure 5b-d).Kini nga mga resulta kusganong nagsugyot nga ang DARS-AS1 mahimo’g makapauswag sa pagtubo sa tumor sa vivo.
Mga epekto sa ad DARS-AS1 knockdown sa colorectal oncogenesis sa hubo nga mga ilaga.Ang mga kurba sa pagtubo (a), gidak-on sa tumor (b), gibug-aton (c), ug mga hulagway sa tumor (d) gipakita.Ang mga error bar nagrepresentar sa ± SEM. n = 10. ****p <0.0001, pinaagi sa two-tailed Student's t test. n = 10. ****p <0.0001, pinaagi sa two-tailed Student's t test. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 duha ka ikog nga t-test sa Estudyante.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 duha ka ikog nga t-test sa Estudyante.e Kaplan-Meier nag-analisar sa correlation tali sa DARS-AS1 nga lebel sa ekspresyon ug sa kinatibuk-ang survival sa mga pasyente nga adunay UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, ug LGG.Ang taas nga lebel sa DARS-AS1 nga ekspresyon sa mga pasyente anaa sa ibabaw nga 50%;ang ubos nga lebel sa DARS-AS1 nga ekspresyon sa mga pasyente anaa sa ubos nga 50%.Ang p-values gitino gamit ang log rank test.f Gisugyot nga modelo diin ang DARS-AS1 nag-regulate sa PACT-PKR nga agianan ug pagtubo sa tumor.
Aron mas masabtan ang klinikal nga epekto sa DARS-AS1, among gisusi ang correlation tali sa ekspresyon niini ug survival sa pasyente.Pinaagi sa pag-analisar sa TCGA dataset, among nakita nga ang mas taas nga DARS-AS1 nga ekspresyon nalangkit sa uveal melanoma (UVM), renal chromophobia (KICH), renal papillary cell carcinoma (KIRP), mesothelioma (MESO), multiplex.Ang mas ubos nga pagkaluwas adunay kalabotan sa glioblastoma morphosis (GBM) ug mga pasyente nga adunay low-grade brain glioma (LGG) (Figure 5e).Kini nga mga resulta nagsugyot nga ang DARS-AS1 mahimong adunay hinungdanon nga papel sa pag-uswag sa klinikal nga tumor ug mahimo’g usa ka potensyal nga predictive biomarker sa daghang mga kanser.
Sa kini nga pagtuon, gamit ang dako nga CRISPRi functional screening, among nahibal-an nga ang DARS-AS1 lncRNA nagbuntog sa tensiyon sa selula sa kanser pinaagi sa pag-regulate sa duha ka hinungdan nga stress responders, PACT ug PKR.Pinaagi sa direktang pagpakig-uban sa PACT, ang DARS-AS1 nagpugong sa pagpaaktibo sa PKR nga gipataliwad-an sa PACT, sa ingon nagpugong sa apoptotic cell death ug nagpasiugda sa pagdaghan sa selula (Fig. 5f).Ang pag-uswag sa DARS-AS1 naobserbahan sa daghang mga tipo sa kanser, nga nagsugyot nga ang gimbuhaton niini sa pagpauswag sa pagkaluwas sa mga selula sa kanser sa ilawom sa mga tensiyonado nga kahimtang mahimo’g magamit sa daghang mga lahi sa kanser.
Ang PACT giila nga usa ka protina sa PKR activator, ug ang pagpaaktibo sa PKR nga gipataliwala sa PACT adunay hinungdanon nga papel sa mga tubag sa stress pinaagi sa pag-regulate sa transkripsyon, paghubad, apoptosis, ug uban pang hinungdanon nga mga proseso sa cellular62.Sulod sa mga dekada, ang mga pagsulay gihimo aron masabtan ang piho nga regulasyon sa kanser sa PACT-PKR cascade.Dinhi, ang among pagtuon nagpadayag usa ka lainlaing mekanismo sa regulasyon sa PACT-PKR sa mga selula sa kanser pinaagi sa cellular lncRNA DARS-AS1, nga direktang nagbugkos sa PACT, gibabagan ang interaksiyon sa PACT-PKR, gipugngan ang pagpaaktibo sa PKR ug eIF2α phosphorylation, sa ingon nagpugong sa apoptosis nga gipahinabo sa stress ug makapadasig sa umaabot nga pagdaghan sa kanser.mga selula.Kini nga pagkadiskobre naghatag kahayag sa potensyal nga mga target sa lncRNA alang sa prognosis ug terapiya sa kanser.
Gipakita sa among datos nga ang pagtuktok sa DARS-AS1 nagpasensitibo sa mga selyula sa kagutom sa serum nga adunay daghang pagtaas sa phosphorylated PKR ug eIF2α.Kini nga mga resulta nagsugyot nga ang DARS-AS1 nagpasiugda sa pagkaluwas sa selula sa kanser ubos sa mapintas nga mga kondisyon pinaagi sa pagpugong sa kalihokan sa PACT/PKR.Daghang uban pang mga non-coding nga RNA, sama sa ASPACT ug nc886, nalambigit usab sa axis sa PACT/PKR pinaagi sa pagpaubos sa PACT48 mRNA o pag-regulate sa autophosphorylation pinaagi sa pagbugkos sa PKR49,50,64.Lakip niini, ang DARS-AS1 naglihok isip tigbabag sa asosasyon sa PACT-PKR.Gipauswag sa kini nga pagtuon ang among pagsabut sa regulasyon sa axis sa PACT/PKR ug ang papel sa mga lncRNA sa mga tubag sa stress.
Ang PACT adunay tulo ka managlahing domain.Ang matag usa sa unang duha ka dsRBDs igo na aron makab-ot ang taas nga affinity binding sa PACT ngadto sa PKR, samtang ang ikatulo nga domain (D3) gikinahanglan para sa PKR activation in vitro ug in vivo.Gipakita sa among pagtuon nga ang DARS-AS1 mas gusto nga makig-uban sa D3 domain (Fig. 3h).Tungod sa dako nga gidak-on sa lncRNA (768 nucleotides), ang DARS-AS1 nga nagbugkos sa D3 mahimong pisikal nga makapugong sa interaksyon tali sa PACT domain sa dsRBD ug PKR, sa ingon makababag sa asosasyon sa PACT ug PKR.Ang mga mutasyon sa PACT point nga nagpuli sa Ser246 ug Ser287 sa D3 nga adunay alanine o aspartate nakabalda sa pagbugkos niini alang sa DARS-AS1, nga nagpunting sa kamahinungdanon sa kinatibuk-ang istruktura ug elektrikal nga mga kabtangan sa D3 sa ilang asosasyon.Ang dugang nga mga detalye niini nga mekanismo gikinahanglan sa umaabot, gamit ang mas tukma nga biochemical analysis ug taas nga resolusyon nga PACT structural analysis.
Ang nangaging mga pagtuon nagtaho nga ang DARS-AS1 nagpasiugda sa pagdaghan sa selula pinaagi sa daghang mga mekanismo51,52,53.Sa usa ka pananglitan, naobserbahan sa mga imbestigador nga gipataas sa DARS-AS1 ang antisense protein-encoding nga DARS gene pinaagi sa pag-target sa miP-194-5p sa mga selula sa kanser sa kidney.Bisan pa, sa karon nga pagtuon, ang DARS-AS1 knockdown adunay gamay nga epekto sa transkripsyon sa DARS sa daghang mga klase sa kanser, lakip ang labing menos nga mga kanser sa colorectal, suso, ug atay.Tungod kay ang lncRNAs nagpakita sa cell- ug tissue-specific nga mga pattern sa ekspresyon, ang mga mekanismo sa pag-andar mahimong dili matipigan sa mga tipo sa kanser, nga mahimong makatampo sa kini nga kalainan tali sa among mga obserbasyon ug sa miaging mga pagsusi sa lainlaing mga kanser.Espesyal nga mga pagtuon gikinahanglan aron sa pagpatin-aw sa piho nga mga mekanismo sa nagkalain-laing physiological ug pathological proseso.
Ang usa ka pag-analisa sa klinikal nga datos nagpakita nga ang DARS-AS1 nga ekspresyon sa mga tumor inversely correlated sa survival sa mga pasyente sa kanser, nga nagpasiugda sa importansya sa DARS-AS1/PACT/PKR axis sa cancer prognosis.Sa konklusyon, gipakita sa among pagtuon nga ang DARS-AS1 usa ka regulator sa PACT/PKR signaling axis, nagpasiugda sa pagdaghan sa selula sa kanser, ug nagpugong sa apoptosis sa panahon sa pagtubag sa stress, nga naghatag og laing linya sa panukiduki ug interesado alang sa umaabot nga panukiduki sa mga potensyal nga pagtambal. .
Ang mga linya sa selula sa tawo SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 ug HEK293T nakuha gikan sa National Cell Line Resource Infrastructure sa China.Ang tanan nga mga selula gipadayon sa DMEM medium (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) nga gidugangan sa 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) ug 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) sa 37 ° C, 5% CO2.incubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (phosphorus S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (phosphorus S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulin, CST (2128);normal nga mouse IgG, CST (5415S);normal nga koneho IgG, CST (2729S).Ang mga antibodies natunaw sa 1: 1000 sa PBST alang sa Western blotting ug 1: 100 alang sa IP.
Ang mga sgRNA gihimo gamit ang usa ka magamit sa publiko nga himan nga gitawag CRISPR-ERA66.Gigamit namo ang default tool parameters para sa sgRNA development ug ang algorithm nag-compute sa sgRNA binding sites sa 3 kb region.nakasentro sa TSS.Ang mga pool sa sgRNA oligonucleotides gi-synthesize sa CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) ug gi-clone sa humanized pgRNA plasmids (Addgene #44248).Usa ka kinatibuk-an nga 12 μg sa pooled humanized pgRNA plasmid, 7.2 μg sa psPAX2 (Addgene #12260), ug 4.8 μg sa pMD2.G (Addgene #12259) ang co-transfected ngadto sa 5 x 106 HEK293T dishes gamit ang DNAagent Transfection sa 10 cell (CWBIO, Beijing, China) nga nagsunod sa mga instruksyon sa tiggama.Ang mga supernatant nga adunay virus gikolekta 48 ug 72 ka oras pagkahuman sa pagbalhin ug gisala pinaagi sa usa ka 0.45 µm filter.Alang sa screening, ang SW620 nga mga selula nga nagpahayag sa dCas9/KRAB fusion protein nakuha pinaagi sa virus transduction.Ang nabag-o nga mga selula sa SW620 nataptan sa librarya sa virus sa upat ka independenteng mga eksperimento sa impeksyon sa usa ka MOI nga 0.1-0.3 ug gisampol sa 2 μg / ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) sulod sa 2 ka adlaw.Pagkahuman, ang mga selyula gikultura sulod sa 18 ka adlaw nga in vitro nga adunay labing gamay nga sakup sa librarya nga 500 nga mga cell / sgRNA alang sa screening.
Ang genomic DNA gikuha sumala sa mga instruksyon sa QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Germany; 51183).Sa kinatibuk-an, 100 μg sa genomic DNA matag biolohikal nga pagbalik ang gigamit sa pagtukod sa librarya.Ang rehiyon sa sgRNA gipadako sa duha ka hugna sa PCR ug gisumpay sa usa ka barcode.
Ang mga produkto sa PCR giputli gamit ang NucleoSpin® gel ug PCR purification kit (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germany; 740609.250) ug gi-quantified gamit ang Qubit™ HS double-stranded DNA detection kit (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Ang MTS assay gigamit sa pagsukod sa pagdaghan sa selula.Ang mga selyula gisabod sa 96-well plate sa inisyal nga densidad nga 2000 ka mga selula/tabay.Ang relatibong gidaghanon sa mga selula gisukod adlaw-adlaw sa gitakdang oras alang sa kinatibuk-an nga 4-6 ka adlaw.Alang sa matag atabay, 20 μl sa MTS reagent (Promega) ang lasaw sa 100 μl sa DMEM, gilumlom sa mga selula sulod sa 4 ka oras sa 37 ° C, ug dayon ang OD490 gisukod.
Ang kapasidad alang sa wala sakla nga pagtubo nadiskobrehan pinaagi sa pag-analisar sa pagporma sa mga sphere.Sa laktud, 2000 ka mga selula nga gibalhin sa shRNA DARS-AS1 o pagkontrol sa shRNA gikulata sa ultra low attachment microplates (Corning) nga adunay medium nga pagbag-o matag 4 ka adlaw.Giihap ang mga spheroid pagkahuman sa 14 ka adlaw.Ang 500 nga mga selula nga gibalhin sa DARS-AS1 nga overexpression plasmid o usa ka control plasmid gigamit alang sa pagpauswag sa assay, kung dili ang pamaagi wala mausab.
Ang RNA gi-transcribe gamit ang T7 RNA polymerase ug biotin-16-UTP (Roche 1138908910) sumala sa mga instruksyon sa Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Ang mga primer nga gigamit dinhi gilista sa Supplementary Table 4.
Ang protina-coding PACT o PKR nga mga rehiyon gi-clone sa pET15b (Addgene #73619) ug giusab ngadto sa BL21 (DE3).Ang bakterya gilumlom sa tibuok gabii sa LB nga gihatagan og ampicillin ug dayon lasaw sa 100 ka pilo sa presko nga LB.Kung ang OD600 sa medium nakaabot sa 0.8, gidugang ang 1 mM IPTG aron mapukaw ang ekspresyon sa protina.Human sa paglumlum sa tibuok gabii uban sa malumo nga pag-uyog (250 rpm sa 20 ° C), ang cell pellet nakolekta pinaagi sa centrifugation (4000 rpm, 10 min, 4 ° C).I-resuspend ang cell pellet sa lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) ug i-incubate sa yelo sulod sa 30 min, dayon sonicate (15 min, 5 s on/off, on ice) ug centrifuge (13,000). rpm)., 30 min, 4°C).Ang supernatant gikarga dayon sa Ni-NTA resin (QIAGEN) 3 ka beses sa 4 ° C, gihugasan 4 ka beses gamit ang wash buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) ug gi-eluted 3 ka beses, nga adunay total. sa 10 ml eluent buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazole).Ang giputli nga protina gitino gamit ang WB ug ang konsentrasyon gitino gamit ang Qubit ™ protein assay kit (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Ang RIP assays gihimo sama sa gihulagway kaniadto, nga adunay mga pagbag-o.Sa mubo, 1x RIP buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) lyses cytostatic 1 x 107 cocktail (Roche, 1 mM DTT) ug centrifuge sa 13,000 rpm sa 15 min sa 4 °C.Ang supernatant dayon gilumlom sa protina A + G magnetic beads (Millipore) conjugated sa 5 μg sa anti-PACT antibody (Abeam) o IgG (CST).Ang mga lubid gihugasan 5 ka beses gamit ang 5x RIP buffer, dayon gitunaw sa proteinase K (NEB).Ang RNA gikuha sa Trizol ug gitino sa RT-qPCR.Ang mga primer gipresentar sa Supplementary Table 5.
Ang in vitro RIP assay gihimo sumala sa giusab nga standard RIP assay protocol.Usa ka kinatibuk-an nga 5 pmol sa in vitro transcribed RNA ang lasaw 1x sa RIP buffer ug annealed pinaagi sa paglumlum sa 65 ° C sulod sa 5 minutos nga gisundan sa hinay nga pagpabugnaw sa temperatura sa lawak.Usa ka kinatibuk-an nga 5 pmol sa intact o mutated flag-labeled PACT nga mga protina ang giputli gikan sa E. coli.Paglumlom sa renatured RNA sulod sa 2 ka oras sa 4°C ug sunda ang pamaagi sa ibabaw para sa RIP analysis para sa anti-flag IP.
Alang sa pag-analisar sa extension sa RNA, ang 1 × 107 nga mga selula gi-lysed sa 1xRIP buffer.Human sa centrifugation sa 13,000 rpm alang sa 15 min sa 4 ° C, ang supernatant pretreated sa 30 μl sa streptavidin magnetic beads (Beckman) sulod sa 2 ka oras sa 4 ° C.Ang giputli nga lysate dayon gihatagan og yeast tRNA ug gilumlom sa 40 pmol sa renatured RNA sa tibuok gabii sa 4 ° C, unya alang sa laing 2 ka oras ug 20 μl sa bag-ong streptavidin magnetic beads nga gibabagan sa BSA gidugang.Ang lakang sa paghugas naglangkob sa 4 ka beses nga adunay 5x RIP buffer ug 4 ka beses nga adunay 1x RIP buffer.Ang katugbang nga mga protina gi-eluted sa biotin elution buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) ug gibulag sa NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Pagkahuman sa pilak nga pagmantsa (Beyotime Biotechnology), ang pipila nga mga banda gikuha ug gisusi sa MS.
Ang pagtuki sa co-IP gihimo aron sulayan ang interaksyon tali sa PACT ug PKR.Sa mubo, ang mga supernatant lysate giandam pinaagi sa paglumlom sa 1 x 107 lysed cells sa 1 x RIP buffer nga gisundan sa centrifugation sa 13,000 rpm sulod sa 15 minutos sa 4 ° C.Ang mga lysate puno sa protina A + G magnetic beads, gihugpong sa 5 µg nga anti-PACT antibody, ug hinayhinay nga gituyok sa tibuok gabii sa 4°C.Ang mga lubid gihugasan 3 ka beses nga adunay 5 × RIP buffer, kaduha sa 1 × RIP buffer ug gi-eluted sa 1 × SDS buffer.Ang nakuha nga protina gisusi sa SDS-PAGE gel ug nakit-an sa WB.
Duha ka pmol sa gi-flag nga PACT ug 1 pmol sa PKR ang giputli gikan sa E. coli.Dilute sa 1× RIP buffer ug paglumlom sa 10 pmol sa renatured RNA sulod sa 2 ka oras sa 4 °C.Human niana, sila gilumlom sa protina A+G magnetic bead-conjugated anti-labeled antibody alang sa dugang nga duha ka oras.Ang mga beads dayon gihugasan upat ka beses gamit ang 1x RIP buffer ug gi-eluted sa 1x SDS buffer.Ang resulta nga PACT ug PKR namatikdan ni WB.
Oras sa pag-post: Sep-23-2022
